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1、 病毒与细胞间的相互作用病毒与细胞间的相互作用第一节第一节 病毒的细胞培养病毒的细胞培养第二节第二节 病毒与细胞的相互作用病毒与细胞的相互作用第一节第一节 病毒的细胞培养病毒的细胞培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（感动物（动物接种动物接种）、鸡胚（）、鸡胚（鸡胚接种鸡胚接种）或）或离体细胞进行分离培养（离体细胞进行分离培养（细胞培养细胞培养）。）。一、动物接种一、动物接种接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。按病毒侵袭部位不同
2、选择适当按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。纯疱疹病毒接种于家兔角膜。动物接种的优缺点：动物接种的优缺点：优点：优点：（1）不需要复杂的仪器设备；不需要复杂的仪器设备；（2）技术简单；）技术简单；（3）易成功）易成功缺点：缺点：（1）个体差异大）个体差异大 （2）价格昂贵）价格昂贵 （3）数量有限）数量有限 （4）需要隔离畜舍）需要隔离畜舍二、鸡胚接种二、鸡胚接种一种比较经济简便的方法。一种比较经济简便的方法。卵壳卵壳壳膜壳膜鸡胚接种的优缺点：鸡胚接种的优缺点：优点：优点：技
3、术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大，不需特殊设备不需特殊设备 缺点：缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。细胞培养细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬个细胞团悬液进行培养。液进行培养。三、细胞培养三、细胞培养n每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等等n无个体差异，准确性和重复性好无个体差异，准确性和重复性好n可严格执行无菌操作可严
4、格执行无菌操作n细胞培养本身就能显示病毒的生长特征细胞培养本身就能显示病毒的生长特征n应用空斑技术可进行病毒的克隆化应用空斑技术可进行病毒的克隆化优点：优点：根据细胞来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型：根据细胞来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型：n原代细胞：原代细胞：动物组织经胰蛋白酶消化处理，使细胞分散动物组织经胰蛋白酶消化处理，使细胞分散而得到的细胞。而得到的细胞。n二倍体细胞：二倍体细胞：将长成单层的原代细胞消化分散成单个细将长成单层的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样，保持其胞，继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样，保持其二倍染色体数目
5、的细胞，称为二倍体细胞。二倍染色体数目的细胞，称为二倍体细胞。n传代细胞：传代细胞：能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成。细胞或二倍体细胞突变而成。（一）细胞的类型（一）细胞的类型（二）细胞培养的方法（二）细胞培养的方法1.静置培养：静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。上生长分裂，最后长成单层。2.旋转培养：旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细
6、胞贴附于玻瓶四周，长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。长成单层。第二节第二节 病毒与细胞的相互作用病毒与细胞的相互作用n杀细胞感染杀细胞感染n非杀细胞感染非杀细胞感染 引致持续感染，对细胞代谢无影响。引致持续感染，对细胞代谢无影响。n产生干扰素产生干扰素 由病毒感染导致的细胞损伤。由病毒感染导致的细胞损伤。CPECPE能在光学显微镜下观察。能在光学显微镜下观察。细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞聚合，如腺病毒；细胞聚合，如腺病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；有些病毒能形成包涵体有些病
7、毒能形成包涵体。一、病毒引致的杀细胞变化一、病毒引致的杀细胞变化（一）细胞病变效应（一）细胞病变效应(cytopathic effect,(cytopathic effect,CPECPE)正常细胞正常细胞CPECPE观察观察正常单层正常单层A72A72细胞细胞接种接种CCVCCV后出现细胞拉网后出现细胞拉网的的单层的的单层A72A72细胞细胞CPE观察观察CPE观察正常单层正常单层A72A72细胞细胞接种犬冠状病毒（接种犬冠状病毒（CCVCCV）后形）后形成合胞体的的单层成合胞体的的单层A72A72细胞细胞合胞体（合胞体（syncytia）是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜是病毒感染后
8、导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞。融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞。能够使半数组织细胞在一定条件下发生细能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力。胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力。50%50%组织细胞感染量（组织细胞感染量（TCIDTCID5050）（二）空斑试验（二）空斑试验将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞培养将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞培养中，当病毒吸附细胞后，再覆盖一层融化中，当病毒吸附细胞后，再覆盖一层融化的琼脂。病毒在细胞内复制后产生局限性的琼脂。病毒在细胞内复制后产生
9、局限性病灶，病灶逐渐扩大，肉眼也能看见，此病灶，病灶逐渐扩大，肉眼也能看见，此即即空斑试验空斑试验。空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，称为称为空斑形成单位（空斑形成单位（PFU）。病毒悬液中的感染性病毒量以每。病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的毫升含有的PFU来表示。来表示。CELLS空斑试验的用途：空斑试验的用途：1.测定病毒数量测定病毒数量2.纯化病毒纯化病毒 单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，可获得病毒克隆。可获得病毒克隆。3.鉴定病毒鉴定病毒 不同病毒的空斑具有不同的
10、特征。不同病毒的空斑具有不同的特征。（三）包涵体（三）包涵体（inclusion body)定义：定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，称为包涵体。称为包涵体。包涵体的性质包涵体的性质n病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Negri氏体氏体n大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的
11、包涵体的包涵体n细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体包涵体狂犬病毒包涵体（狂犬病毒包涵体（Negri body）定义：定义：由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。种类：种类：、干扰素。干扰素。抗病毒作用：抗病毒作用：干扰素不直接作用于病毒，而是作用于干扰素不直接作用于病毒，而是作用于邻近的细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降邻近的细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降解病毒解病毒mRNA、抑制蛋白合成。、抑制蛋白合成。干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性。干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性。二、干扰素（二、干扰素（IFN）干扰素抗病毒机制干扰素抗病毒机制 复习思考题复习思考题1.细胞培养有何优点？细胞培养有何优点？2.原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系的概念。原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系的概念。3.CPE、PFU、空斑、包涵体和干扰素的概念。、空斑、包涵体和干扰素的概念。4.试述干扰素的抗病毒机制。试述干扰素的抗病毒机制。
