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1、第第 1111章章 基因治疗基因治疗Gene TherapyGene Therapy p498本章内容提示基因治疗（基因治疗（Gene therapy）（Gene therapy）一、基因治疗策略一、基因治疗策略 策略：直接基因治疗和间接基因治疗策略：直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗：、直接基因治疗：纠正纠正突变基因突变基因 在在原位原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较为较理想理想的基因治疗策略，由于存在某些问的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）题，目前正在努力之中。（未实现）2 2、间接疗法：、间接疗法：以正常的基因以正
2、常的基因替代替代致病基因致病基因。导入外源正常基因，导入外源正常基因，代替代替有缺陷的基因。而有缺陷的基因。而 对靶细胞而言，对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因没有去除或修复有缺陷的基因。用用DNADNA重组技术重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。目的。途途 径径:就基因转移的就基因转移的受体细胞受体细胞不同，不同，基因治疗有两种途径：基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗、生殖细胞基因治疗 2、体细胞基因治疗、体细胞基因治疗 1、生殖细胞基因治疗l将正常基因转移到患者生殖
3、细胞（精细胞，将正常基因转移到患者生殖细胞（精细胞，卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。卵细胞，早期胚胎）使其发育成正常个体。为为理想理想的治疗方法，从的治疗方法，从根本根本上治疗遗传病，上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中散播。使其有害基因不能在人群中散播。但还存在某些问题：但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用）基因转移效率不高，只能用显微注射显微注射方法；方法；3）只适用于排卵周期）只适用于排卵周期短而次数多短而次数多的动物，很难适的动物，很难适用于人类。用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的
4、解决了（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多个，多者十几个。）者十几个。）2体细胞基因治疗somatic cell gene therapy 措 施：（1 1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。表达后，再回输到体内。（2 2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体 上，准确的替换异常基因，是上，准确的替换异常基因，是理想理想的措施。的措施。（3 3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达）随机整合，非特定座位，只要有效
5、的表达 即可达到治疗的目的。即可达到治疗的目的。（4 4）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体）体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体 细胞。细胞。存在的问题 l对特定座位基因转移，目前还存在较大对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；困难；l随机插入可能引起后代的基因突变。随机插入可能引起后代的基因突变。二二、基因治疗的方法、基因治疗的方法基因治疗的关键性步骤基因治疗的关键性步骤-目的基因的目的基因的获得与转移获得与转移 正常基因的分离与克隆正常基因的分离与克隆二）外源基因的转移l通过不同方法，将目的基因转移至受体通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。细胞。1）物理方法 （2 2）显微注射法
6、）显微注射法（microinjection microinjection）利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核 例：转基因动物的制备)（3）微粒子轰击法2）化学法磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNADNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。磷酸钙磷酸钙+DNA 混合微细颗粒混合微细颗粒 沉淀反应沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露细胞在沉
7、淀物中暴露 524h 方法方法简单简单，但转化，但转化效率低效率低。3 3）脂质体法（）脂质体法（liposomeliposome）DNA PEG DNA脂膜脂膜4 4）同源重组法）同源重组法 同源重组（同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在外源基因和染色体上的基因在同源序列同源序列间间发生重组而插入染色体。发生重组而插入染色体。是将外源基因是将外源基因定位定位导入细胞的染色体上。导入细胞的染色体上。单交换单交换 双交换双交换 通过同源重组定点插入珠蛋白基因Xba IBstXIXba IneoXbaIBstXIneo正常基因座位正常基因座位带有珠
8、蛋白基带有珠蛋白基因的质粒因的质粒 重组后，插入外源基因片段带有重组后，插入外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入新基的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。5 5）病毒介导基因内转移（）病毒介导基因内转移（Viral mediated Viral mediated transfertransfer）感染细胞重组病毒 逆转录病毒逆转录病毒(RNA)(RNA)常用的病毒载体常用的病毒载体 DNADNA病毒病毒 1)1)逆转录病毒（逆转
9、录病毒（retrovirusretrovirus）目前应用最多、最成功目前应用最多、最成功.病毒感染细胞后，病毒感染细胞后，其基因组其基因组RNA RNA 经逆转录产生双链经逆转录产生双链DNADNA拷贝，插入宿拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（主染色体形成前病毒（provirusprovirus），前病毒转录），前病毒转录产生的正链既是病毒产生的正链既是病毒RNARNA，再与前病毒编码的外壳，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。蛋白包装成新的病毒颗粒。例如：小鼠白血病病毒（例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLVMo-MLV）基因）基因组结构：组结构：LTR LTR gag pol envU
10、3 R U5 U3 R U5 逆转录病毒载体优点：缺 点 6）受体载体转移法细胞膜细胞膜三）靶细胞的选择三）靶细胞的选择l靶细胞靶细胞是指接受外源是指接受外源GeneGene的的体体细胞细胞选择靶细胞的选择靶细胞的原则原则是：是：1 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术 操作；操作；2 2）易于由人体分离又便于输回体内）易于由人体分离又便于输回体内3 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至 几年，或整个生命周期）几年，或整个生命周期）4 4）易于受外源遗传物质转化。）易于受外源遗传物质转化。常见的靶细胞常
11、见的靶细胞l外周血外周血T T淋巴细胞淋巴细胞l上皮细胞上皮细胞l内皮内皮l皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞l造血干细胞造血干细胞地中海贫血、严重地中海贫血、严重 复合免疫缺陷病等基因治疗复合免疫缺陷病等基因治疗l肝肝C C家族性高胆固醇血症、低密度家族性高胆固醇血症、低密度 脂蛋白病的基因治疗脂蛋白病的基因治疗l肌细胞肌细胞三、三、GeneGene治疗的现状与前景治疗的现状与前景：具备下列条件基因治疗实例 2、乙型血友病、乙型血友病Xq26.3q27.2。+FcDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 33、黑色素瘤的基因治疗例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因例：细胞因子
12、基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗治疗IL-2 Gene TNF-Gene 4、自杀基因的基因治疗、自杀基因的基因治疗 原理：原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种即用（逆转录）病毒载体将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种此酶可将一种无害无害的药物前体转变为的药物前体转变为细胞毒细胞毒复合物复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的特定的组织或肿瘤组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。中表达，而正常细胞中不表达。：药物前体药物前体 无毒无毒
13、Gene酶酶 药物复合物药物复合物 有毒有毒 细胞死亡细胞死亡反义核酸基因治疗反义基因治疗 DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达 四、四、基因治疗存在的问题与论理学基因治疗存在的问题与论理学一）导入基因的持续性和高效表达一）导入基因的持续性和高效表达如何提高基因的持续高效表达如何提高基因的持续高效表达，从下列几方面考虑：，从下列几方面考虑：1 1、选择高效的基因转移方法；、选择高效的基因转移方法；2 2、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞）、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞）3 3、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，以使以使GeneGene高效表达）高效表达）二）二）GeneGene治疗与社会伦理道德治疗与社会伦理道德e
