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1、眼科角膜共聚焦显微镜检查操作技术角膜共聚焦显微镜(CMTF)全称为扫描裂隙角膜共聚焦显微镜，简称共焦显微镜，是近年来发展起来的一种活体显微检查技术。1955年Minsky发明了第一台用于研究脑神经网络的共焦显微镜，Cavanagh等于1986年将其应用于眼科的动物实验，又于1989年首次用于活体人眼的观察。此后，共焦显微镜在角膜病的基础研究和临床工作中得到广泛应用，使角膜病的研究和诊断水平向前推进了一大步。一、基本原理角膜共聚焦显微镜的原理是利用共姬焦点技术，运用光扫描对活体组织进行三维空间的显示和实时的观察，其获得图像的扫描范围为300m400m,厚约5um,放大倍数100o倍，X、Y、Z轴
2、由三轴机器杆控制，移动范围可精确到小于IUn1。与普通的光学显微镜相比，它具有高分辨率和图像高对比度的特点，能够在细胞水平对活体角膜进行无创伤的动态观察。临床主要有两种类型：TandenISCanning共焦显微镜和Confoscan裂隙扫描型共焦显微镜。目前共焦显微镜已由录像系统转化为数码摄像系统，使图像更为清晰、完整，图片摄取速度更快捷，如Confoscan2.0共焦显微镜。近来，激光角膜共焦显微镜也已用于临床，其图像清晰、分辨率高至1um、可对角膜病变和角膜缘疾病进行多层次立体及连续动态观察。我科首次应用激光共焦显微镜(HRTII/RCM)对正常人活体角膜缘和角膜中央组织结构进行了观察，
3、获得了传统光学共焦显微镜无法获得的图像和效果，填补了活体观察角膜缘的空白。共焦显微镜由三大部分组成：主机：由一个一维的扫描裂隙装置和一个与图像光路相一致的物体聚集盘组成，在一维的光切面上做三维的点状分层扫描。光学传输系统：把连续、同步的光扫描信号传到计算机屏幕和录像机磁带上。计算机分析系统：对记录在录像带上的图像进行分析、处理得到较清晰的图片资料。对角膜的各层细胞数、大小、面积进行统计和数据分析。二、临床意义(1)快速无创伤地诊断角膜感染、营养不良、变性等角膜疾病。(2)观察屈光性角膜手术、角膜缘和角膜移植术后角膜各层细胞和神经纤维等组织结构的变化。(3)观察泪液膜和角膜各层细胞的变化及角膜缘
4、干细胞是否缺乏。(4)随访配戴不同接触镜后的角膜结构状态的改变。(5)观察不同眼药水在角膜各层组织中的渗透。(6)动态观察新生血管在角膜内的增生变化过程、角膜上皮和内皮损伤的修复。(7)储存受检者的角膜资料，利于将来的对照观察和研究。三、检查方法(1)先行角膜表面麻醉，滴0.5%丁卡因12次，嘱睁大眼，对配合欠佳者可行开睑器开睑。(2)摄像镜头用75%乙醇浸泡、擦拭消毒，对可疑感染性角膜病变患者要严格消毒，避免交叉感染。(3)下颌置于托架上，额部顶紧托架上方的头带，保持头与显微镜的镜头相垂直。(4)镜头上覆以适量的黏弹剂做介质(过多易流失，过少影响图像清晰)。(5)对准中心区或有选择地对病变处
5、进行扫描。至少测2个点，以提高阳性率。(6)扫描图像通过计算机显示屏幕快速显示，并被记录在录像机或计算机系统(整个过程约1分钟)。(7)结果处理：对角膜各层的细胞形态、神经生长情况、病原体的大小、形态进行计算分析，图像资料可经数字化处理存于磁盘，随时打印。四、结果分析1 .正常角膜结构共焦显微镜下所见到的正常角膜结构分5层：上皮细胞、基底上皮、前基质、后基质和内皮细胞层。一般情况下，角膜前、后弹力层不能被显示，前弹力层只见神经纤维丛，呈一白线状。正常人角膜表层上皮为扁平细胞，有高亮度的细胞核。角膜基质细胞在正常条件下仅能见到排列整齐、反光强的基质细胞核，暗背景光下能见到基质细胞的内部联结，前基
6、质较后基质细胞密度高，形态略不规则；内皮细胞则为均匀规则的高反光六角形细胞。利用Z-scan功能，共焦显微镜可测量出角膜厚度、角膜基质的混浊程度和深度以及任一图像的深度。2 .感染性角膜病的表现共焦显微镜下，棘阿米巴感染的角膜上皮下和浅基质中可发现棘阿米巴包囊，直径1225m,圆形白点状，较炎性细胞大，滋养体较难发现，在异常的角膜前基质内留有幡、沟和腔，一些腔内是单个包囊或多个包囊；真菌性角膜炎的病灶中可清晰地显示出菌丝，综合分析真菌的直径、长度、分支的角度等，可粗略鉴别真菌感染的菌属，谢立信等报道共焦显微镜下真菌性角膜炎的诊断率为98%以上；疱疹性角膜炎的特点是在病毒侵袭的角膜处有比正常扩大
7、的上皮细胞，前基质层纤维化，上皮下神经丛消失，可能与单疱病毒性角膜炎角膜的敏感性下降有关；细菌感染性角膜炎，目前在共焦显微镜下尚不能区别何种细菌感染，可见上皮或基质层感染灶内有大量的炎性细胞聚集,病灶周围角膜基质细胞密度增大。3 .角膜变性和营养不良的表现在共焦显微镜下，Fuchs角膜内皮营养不良可见多种形态的角膜内皮黑区和不规则或扩大的角膜内皮细胞，常伴有不完整的角膜上皮和基质的混浊；地图-点状-指纹状角膜营养不良，可见角膜上皮基底膜有皱褶和代表小囊肿的上皮下的小的高反射圆点；颗粒状角膜营养不良显示角膜基质细胞密度增高，纤维排列紊乱;虹膜角膜内皮综合征发现角膜内皮呈上皮样外观，而且是多层细胞
8、；MeeSmann角膜营养不良仅有点状囊肿样改变；圆锥角膜的后期可见角膜中央表皮脱落，上皮变形，前弹力层下的基质内胶原排列紊乱，深基质可见皱褶，部分区域后弹力层和内皮剥脱。.屈光性手术后共焦显微镜下角膜的特点PRK术后角膜变化显示在前基质层，不同时间细胞数目变化不同，1周内基质细胞明显减少，10天、1个月基质细胞数目增加，3个月减少，6个月后逐渐恢复正常。共焦显微镜可发现haze及亚临床hazeoPRK术后上皮下的神经再生是从切削区的周边部开始的，术后1个月能观察到纤细的少量上皮下神经，术后68个月神经再生基本停止，但结构仍不正常。1.ASIK术后各时间点角膜细胞及角膜厚度变化很小，上皮细胞层
9、保持完整，基质的反应明显较PRK术后轻微，细胞反应主要表现在基质板层切口前后面，并可见层间残留的微小颗粒和杂质。LASIK术后神经的再生过程基本上同PRKo4 .角膜移植术后伤口愈合和神经再生以及免疫排斥反应RiChter发现PKP术后8周植片周边可见神经长入，7个月时角膜中央基质出现粗大的神经干，2年后分支达到上皮下，3年时分布尚不正常；移植术后免疫排斥反应的早期可见渗入角膜基质层的白细胞，大部分围绕在缝线和新生血管的周围，并伴有周围角膜基质细胞的减少，这些炎症细胞主要是来自于新生血管的渗出，部分沿缝线来自于植床。角膜上皮排斥线表现为大量的炎性细胞和被破坏的上皮细胞，上皮下浸润表现为细胞外间
10、质大量反光的炎性细胞，在基质排斥中，可见水肿的角膜基质内大量炎性细胞，KP表现为突出于前房的炎性细胞的积聚，而内皮排斥线则表现为被破坏的、核反光强的内皮细胞和炎性细胞的积聚。出现移植片的混浊,是由于白细胞的浸润，加上角膜基质细胞的变性所致。无论急性或迟发排斥，应用抗排斥药物后，炎性细胞逐渐消失。五、实用价值共焦显微镜是提高角膜疾病的基础研究和临床诊断水平的重要工具，是目前其他活体检查技术所不及的。但它也有其不足的方面，如不易获得清晰的图像，强光刺激给患者带来眼部不适感，临床疾病诊断方面也尚需进一步积累资料等。相信随着科技的进步，共焦显微镜对屈光性角膜手术后的观察、角膜缘和角膜移植术后的观察、角膜感染等疾病的无创快速诊断、配戴角膜接触镜后的角膜状态随访等有着广阔的发展前景。
