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1、附件2肉制品中刚果红的测定BJS2018071范围本方法规定了肉制品中刚果红的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于肉制品中刚果红的测定。2原理试样经氨水乙醇溶液提取,用正己烷去除提取液中的脂肪后用液相色谱串联质谱法进行测定，外标法定量。3试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 乙腌(C2H3N)：色谱纯。3.1.2 甲醇(CH3OH)：色谱纯。3.1.3 乙醇(C2H5OH)：色谱纯。3.1.4 正己烷(C6Hi4)：优级纯。3.1.5 甲酸镂(CH5NO2)：色谱纯。3.1.6 氨水(NH3H2O)：含量2
2、5%28%3.2 试剂的配制3.2.1 氨水乙醇溶液(20+80)：移取氨水(3.1.6)20mL,加入80ml乙醇(3.1.3),混匀备用。3.2.2 5mmolL甲酸镀溶液：称取甲酸铉(3.1.5)0.315g,加适量的水溶解，定容至IooOmL,混匀。3.3 标准品刚果红标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1,纯度298%表1刚果红标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量刚果红CongoRed573-58-0C32H22N6Na26S2696.663.4 标准溶液的配制称取IOmg(精确到0.1mg)刚果红标准品
3、于100mL量瓶中，加入少量甲醉溶解后，用甲醇定容，得到100gmL的标准储备溶液，4C避光保存6个月。4仪器和设备4.1 液相色谱四极杆串联质谱仪，配电喷雾(ESI)离子源4.2 涡旋振荡器4.3 组织捣碎机4.4 高速离心机，10000r/min4.5 电子天平，感量0.00OIg和0.0Ig4.6 旋转蒸发仪4.7 步骤5.1 试样制备取适量有代表性的试样切成小块，组织捣碎机捣碎，均质分成两份，作为试样和留样,分别装入洁净容器中，密封并标记，于-18C避光保存。5.2 样品前处理准确称取2g(精确至0.0Ig)试样于50mL离心管中，加入IOmL氨水乙醇溶液(3.2.1),在涡旋振荡器上
4、提取2min后置于离心机中以5000r/min离心5min,把上层提取液溶液全部转移至另一离心管中，用IOmL氨水乙醇溶液重复提取一次，合并提取液。在提取液中加入30mL正己烷于涡旋振荡器上混合2min后，5000r/min离心2min,弃去正己烷，将下层溶液全部转移至旋蒸瓶中，60C下旋蒸至干，用5mL甲醇溶解残渣。取部分溶解液至离心管中，10000r/min离心10min后，取上清液上机测试。5.3 仪器条件5.3.1 液相色谱条件a)色谱柱：Cu5色谱柱(3.0mmX100mm,3.5m),或性能相当者；b)流动相：流动相A为5mmolL甲酸核水溶液，流动相B为乙盾，流动相梯度洗脱程序见
5、表2；6表2梯度洗脱程序时间min流动相A(%)流动相B(%)080205.020806.080208.08020c）流速：0.3mL/min；d）柱温：35；e）进样量：lL6.1.1质谱条件a）电离方式：电喷雾负离子模式；b）检测方式：多反应监测（MRM）；c）雾化气压力：40psi；d）干燥气温度：320；e）干燥气流速：9.0Lmin;f）毛细管电压：4.0kV：g）监测离子对、碎裂电压和碰撞能量见表3。7表3刚果红的监测离子对、碎裂电压和碰撞能量中文名称监测离子对（mz）碎裂电国V）碰撞能量（eV）刚果红325.0/152.013039325.0/416.0*13013注：*为定量离
6、子对7.1 定性确证进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准溶液一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度（k）与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表4中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测组分。8表4定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%k50%5O%k2O%20%k10%k10%允许的相对偏差/%202530507.2 定量测定7.2.1 标准曲线的制备将刚果红标准溶液（3.4）用甲醇逐级稀释成0.25gmLIpg/mL、5gmL10gmL20gmL的标准系列溶液，准确称取与试样基质相应的阴性试样2g（精确至0.01g,
7、按5.2操作未检出325.0/152.0和325.0/416.0离子对），分别加入标准系列溶液ImL,与试样同时进行提取，制成最终浓度为0.05、0.2、1.0、2.0、4.0gmL标准系列工作溶液，将标准系列工作液上机测试，建立响应值与浓度的线性拟合方程。标准谱图见附录A。7.2.2 试样溶液的测定将试样溶液（5.2）按仪器参考条件（5.3）进行测定，得到相应的试样溶液的质量色谱峰面积。根据标准曲线得到试样溶液中刚果红的浓度。7.3 空白试验除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。9结果计算(1)按下式（1）计算试样中刚果红的含量：X-Z,TtzxKBD式中:X试样中刚果红的含量，
8、mg/kg；C试样测定液中待测物含量，gmL;V试样定容体积，mL；m称取样品量，g；了一试样制备过程中的稀释倍数。测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留2位有效数字。10灵敏度当称样量为2.00g时，本方法检出限为0.13mgkg,定量限为0.45mg/kg。11精密度和准确度在0.5mg/kg、1.0mg/kg及5.0mg/kg的添力口水平下，回收率不低于70%,相对标准偏差不高于10%。附录A刚果红标准溶液质量色谱图图1100ngmL刚果红多反应监测（MRM）色谱图本方法负责起草单位：南京市食品药品监督检验院。验证单位：江苏省食品药品监督检验研究院、国家肉类食品质量监督检验中心、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、北京市食品安全监控和风险评估中心、辽宁省食品检验研究院。主要起草人：凌睿、胡文彦、孙小杰、林慧、李志刚、马育松。
