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1、附件10食用油中苯并（a）花的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201910）1范围本方法规定了食用油中苯并（a）花的胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于食用油中苯并（a）花的快速测定。2原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苯并（a）花经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苯并（a）花进行定性判定。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GBZT6682规定的二级水。3.1试剂3.1.1正己烷：色谱纯。3.1.2乙胞：色谱纯。3.1.3二甲
2、基亚飒（DMSO）。3.1.4NaH2P42H2o3.1.5Na2HP04l2H203.1.6氯化钠。3.1.7吐温-20。3.1.8氢氧化钠溶液（2molL）：称取80g氢氧化钠用水溶解，并定容至1L。3.1.9PBST溶液:称取0.2965gNaH2PO42H2O2.9gNa2HPO4HlH2O8.76g氯化钠与0.55g吐温-20用水溶解并定容至1Lo3.2参考物质苯并（a）花参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1,纯度均95%.表1苯并（a）花参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子质量苯并
3、（a）花Benzo(a)pyrene50-32-8C2H12252.32注：或等同可溯源物质。3. 3标准溶液的配制苯并（a）花标准储备液（0.1mgmL）：精密称取适量苯并（a）花标准品（3.2）,置于IOmL容量瓶中，用乙懵（3.1.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.1mgmL的苯并（a）在标准储备液；或可直接购买苯并（a）在标准储备液。OC5避光保存备用，有效期1年。3.4材料苯并（a）在胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为食用油。3.4.1 金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。3.4.2 试纸条或检测卡。4仪器和设备4.1移液器：100L1mL、5mL和IOmL。4.2涡旋混合器
4、。4. 3离心机：转速4000r/min。4. 4电子天平：感量为0.01g。4. 5氮吹仪或空气吹干仪（带温度控制）。5分析步骤4.1 试样制备取适量有代表性样品充分混匀。4.2 试样提取和净化除脂称取IOg油样于离心管中，加入5mL正己烷（3.1.1）和15mLDMSO（3.1.3）并混合均匀。漩涡振荡2min,然后4000r/min离心2min。弃去上层正己烷层。加入5mL正己烷（3.1.1）,漩涡振荡30s,然后40007min离心30s。弃去上层正己烷层。加入10mL氢氧化钠溶液（2molL）（3.1.8）和15mL正己烷（3.1.1）,漩涡振荡30s,然后4000r/min离心30
5、s。吸取上层正己烷层于15mL离心管，4000r/min离心2min。取全部正己烷层于氮吹管中，50C氮吹或空气吹IOmin,吹干后加入200LDMSO（3.1.3）复溶,混合均匀，此为待测液。4.3 测定步骤打开试纸筒，取出所需数量的红色反应微孔（取出微孔后，立即盖好桶盖，以防受潮）。往微孔中力口入200L的PBST溶液，再加入50L待测液，上下抽吸510次至微孔试剂混合均匀，室温（20C25C）反应7min。将已做好标记的试纸条插入至上述红色微孔中，使样品垫充分进入样品中，并计时7min。从微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，进行结果判定。4.4 质控试验每批样品应同时进行空白试验和
6、加标质控试验。4.4.1 空白试验称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。5. 4.2加标质控试验准确称取空白试样（精确至0.0Ig）置于玻璃试剂瓶中，加入一定体积的苯并（a）在标准储备液（0.1mgmL）（3.3.1）,使试样中苯并（a）荏浓度为10gkg,按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。6结果判定方式由于长时间放置会引起质控线（C线）与检测线（T线）颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。试纸条与检测卡如图1所示。结果判定也可根据产品说明书进行。5.1 读数仪测定结果通过读数仪对结果进行判读，根据不同厂家仪器规定进行判读。无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否
7、显色，均表示实验结果无效。阳性：若检测结果显示（阳性），表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检出限。阴性：若检测结果显示（阴性），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限。5.2 目视判定通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。阳性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）不出现或出现但颜色浅于质控线（C线），表示试样中含有待测组分且其含量高于方法检出限，判为阳性。阴性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）颜色深于或等于质控线（C线），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限，判为阴性。
8、6. 3质控实验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。NC膜 吸水纸C线样品垫无效阴性阳性A.试纸条加样孔B.检测卡图1目视判定示意图7结论当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。8性能指标8.1 检测限10gkgo8.2 灵敏度95%o8.3特异性85%o8.4假阴性率5%o8.5假阳性率15%注：性能指标计算方法参见附录A。9其他本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满
9、足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为GB5009.272016食品安全国家标准食品中苯并（a）花的测定。本方法使用试剂盒可能与苯并（a）慈、苯并（b）荧塞、苯并（e）花、苯并（j）荧K等物质存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证。附录A定性方法性能计算表表A.1性能指标计算方法样品情况H检测结果总数阳性阴性阳性NllN12Nl=N11+N12阴性N21N22N2=N21+N22总数N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=Nl.+N2.或N.1+N.2显著性差异（2）2=(NI2-N21-1)2/(N12+N21),自由度(df)=1灵敏度（p+,%）p+=NllNl.
10、特异性（p，%）p-=N22N2.假阴性率（pf-,%）Pf-=NI2/NL=100-灵敏度假阳性率（pf+,%）pf+=N21N2.=100-特异性相对准确度，%c(Nll+N22)/(N1.+N2.)注：&由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：NIl表示第一行，第一列，NL表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：广东省食品检验所。验证单位：成都市食品药品检验研究院、中国农业科学院油料作物研究所。本方法主要起草人：熊含鸿、王立亚、简德威、陈思敏、雷毅
