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1、实时荧光定量PCR详细操作步骤流程原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。步骤一、样品RNA的抽提1. 取冻存己裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。2. 两相分离每IInl的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%o3. RNA沉淀将
2、水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30孵育10分钟后，于4下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。4. RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZ0L试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH20配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。6. 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4Oul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待
3、用。二、RNA质量检测1. 紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1：100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。（1）浓度测定A260下读值为1表示40ugRNAmlo样品RNA浓度（μg/ml）计算公式为：A260X稀释倍数X40ug/ml0具体计算如下：RNA溶于40ulDEPC水中，取5ul,1:100稀释至495Ul的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21X100X40ug/ml=840ug/ml或0.84ug/ul取5Ul用来测量以后，剩余样品RNA为35ul,剩余RNA总
4、量为：35ulX0.84ug/ul=29.4ug（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定（1）制胶1. g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60,10ml的10XMOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M）0IOxMOPS电泳缓冲液配方后台回复“配方”联系灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的IXMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。需PCR缓冲液“配方”后台留言（2）准备RNA样品取3UgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中
5、至终浓度为10ug/mlO加热至70孵育15分钟使样品变性。（3）电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6Vcm电压下2h,电泳至浸酚兰指示剂进胶至少2-3cmo（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更
6、高分子量的弥散迁移物质或者带，弥散。用数码照相机拍下电泳结果。需PCR缓冲液“配方”后台留言三、样品CDNA合成1.反应体系RNA的降解表现为核糖体RNA带的序号反应物1逆转录buffer剂量2ul2上游引物0.2ul3下游引物0.2ul4dNTP0.1ul5逆转录酶MMLV0.5ul6DEPC水7RNA模版5ul2ul8总体积10ul轻弹管底将溶液混合，6OOOrpm短暂离心。2. 混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5ul,37水浴60分钟。3. 取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为CDNA溶液，保存于-80待用。
7、四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（B-actin）实时定量PCR1.-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释（加水27Ul并充分混匀）为Iol0,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。2.反应体系如下:标准品反应体系序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10ul2阳性模板上游引物F0.5ul3阳性模板下游引物R0.5ul4dNTP0.5ul5Taq酶1ul6阳性模板DNA5ul7ddH2O32.5ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6OOOrpm短暂离心。3.管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR
8、Green1染料10ul2内参照上游引物F0.5ul3内参照下游引物R0.5ul4dNTP0.5ul5Taq酶1ul6待测样品cDNA5ul7ddH2032.5ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。3.制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后931分钟，552分钟，共40个循环。五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板1.针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的CDNA模板进行PCR反应。2.反应体系序号反应物剂量1lO×PCR缓冲液2.5ul2MgC12溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5ul5dNT
9、P混合液3ul6Taq聚合酶1ul7CDNA1ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，600OrPm短暂离心。35个PCR循环（94Cl分钟；55Cl分钟；721分钟）；72?C延伸5分钟。（3） PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，溟化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为l×IOl0,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。六、待测样品的待测基因实时定量PCR1. 所有CDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。2. 体系配
10、置如下：序号反应物剂量SYBRGreen1染料上游引物下游引物Taq聚合酶待测样品CDNA轻弹管底将溶液混合，6OOOrpm短暂离心。（3）将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：932分钟预变性，然后按931分钟，551分钟，72Cl分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。需PCR缓冲液“配方”后台留言七、实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：PrimerPremier5.0,并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。八、电泳各样品的目的基因和
11、管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。注意事项：1 .荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用要结合扩增效率，线性回归系数等参数来综合考虑。2 .Ct值：在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。常见问题:实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，
12、通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。3 ）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
