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1、 第二章 色谱法引论Generalization of chromatograph analysis2.1 概述概述2.2 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语2.3 色谱基本理论色谱基本理论2.4 分离度分离度2.1 概述概述o一一 色谱法简介色谱法简介o二二 色谱发展历史色谱发展历史o三三 色谱的分类色谱的分类o四四 色谱法的特点色谱法的特点 经典的分离方法经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取；沉淀、蒸馏和萃取；现代分析中，大量采用现代分析中，大量采用色谱和电泳分离色谱和电泳分离方法。迄方法。迄今为止，今为止，色谱方法是最为有效的现代分离分析手段色谱方法是最为有效的现代分离分析手段！2
2、.1 概概 述述 色谱法是一种色谱法是一种物理化学物理化学分离方法。将这种分离方分离方法。将这种分离方法与适当的法与适当的检测手段检测手段相结合，应用于分析化学领域，相结合，应用于分析化学领域，就是色谱分析法。就是色谱分析法。一、色谱法简介一、色谱法简介 色谱法早在色谱法早在1906年由俄年由俄国植物学家国植物学家MRswett(茨茨维特维特)使用使用CaCO3粉末作粉末作为为 ，石油醚作，石油醚作为为 ,玻璃管作玻璃管作为为 ，分离植物中，分离植物中色素时发现并命名的色素时发现并命名的“色谱色谱法法”(chromatography)色谱法是一种分离技术，其研究对象是复杂的混合物质。色谱法是一
3、种分离技术，其研究对象是复杂的混合物质。固定相固定相流动相流动相色谱柱色谱柱二、色谱法的历史二、色谱法的历史 俄国植物学家茨维特俄国植物学家茨维特Tsweet 首先将这种层析现象用于分离首先将这种层析现象用于分离植物色素红萝卜素、叶黄素和叶绿素植物色素红萝卜素、叶黄素和叶绿素A、B，并将这种方法，并将这种方法命名为色谱法命名为色谱法 液液-固色谱（是最先创立的色谱方法）固色谱（是最先创立的色谱方法）20年后（年后（1931）Kuhn（库恩库恩）为了证实蛋黄中的叶黄素）为了证实蛋黄中的叶黄素是植物叶黄素与玉米黄质的混合物，参考了是植物叶黄素与玉米黄质的混合物，参考了Tsweet 的论文的论文并采
4、用的色谱法进行其研究工作（并采用的色谱法进行其研究工作（吸附色谱）吸附色谱）1938年，年，Martin（马丁马丁）和）和Synge（辛格辛格）采用水分饱和）采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸并且提出了色谱塔板理论氨基酸并且提出了色谱塔板理论 分配色谱分配色谱 1951年，年，Martin 和和James采用气体作为流动相，以自动滴采用气体作为流动相，以自动滴定仪作为检测器分析脂肪酸定仪作为检测器分析脂肪酸 气相色谱法气相色谱法。建立。建立形成色形成色谱学理论中有着重要地位的塔板理论和谱学理论中有着重要地位的塔
5、板理论和Van Deemter方程，方程，以及保留时间、保留指数、峰宽等概念。以及保留时间、保留指数、峰宽等概念。1952年，年，A.J.P.Martin和和 R.L.M.Synge获得了诺贝尔化学奖。获得了诺贝尔化学奖。在他们获得诺贝尔奖的论文中还指出在他们获得诺贝尔奖的论文中还指出“采用气体代替液体采用气体代替液体作为流动相分离各类化合物的可能性是存在的。作为流动相分离各类化合物的可能性是存在的。”“如果如果流动相用气体来代替，对分离更有好处流动相用气体来代替，对分离更有好处”，“使用非常细使用非常细的颗粒填料和柱的两端施加较大的压差，应能得到较小的的颗粒填料和柱的两端施加较大的压差，应能
6、得到较小的理论塔板商理论塔板商”1957年，年，Golay又提出了使用毛细管柱代替填充柱可获得又提出了使用毛细管柱代替填充柱可获得极高的分离效率极高的分离效率毛细管气相色谱法毛细管气相色谱法 从此，气相色谱法得以蓬勃发展。气相色谱学的诞生从此，气相色谱法得以蓬勃发展。气相色谱学的诞生及其获得广泛的应用使色谱学逐渐成为分析化学的一个重及其获得广泛的应用使色谱学逐渐成为分析化学的一个重要分支学科要分支学科1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
7、1960年代年代末末科克兰科克兰等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱高效液相色谱的时代。的时代。1971年科克兰等人出版了年科克兰等人出版了液相色谱的现代实践液相色谱的现代实践一书，一书，标志着高效液相色谱法标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。正式建立。1937-1972年，年，15年中有年中有12个个Nobel奖是有关色谱研究的！奖是有关色谱研究的！三、色谱的分类三、色谱的分类1.1.色谱过程中两相的物理状态分类色谱过程中两相的物理状态分类 2.2.色谱分离过程的作用原理分类色谱分离过程的作用原理分类 3.3.固定相的使用
8、分类固定相的使用分类1.1.色谱过程中两相的物理状态分类色谱过程中两相的物理状态分类3）超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)1）气相色谱气相色谱(GC)：气气固色谱固色谱（GSC）、气、气液色谱液色谱（GLC）2）液相色谱液相色谱(LC)：液液固色谱固色谱（LSC）、液、液液色谱液色谱（LLC）2.2.色谱分离过程的作用原理分类色谱分离过程的作用原理分类吸附色谱法吸附色谱法 adsorption chromatography分配色谱法分配色谱法 partition chromatography离子交换色谱法离子交换色谱法 ion exchange chromatography空间排阻色谱法空
9、间排阻色谱法 steric exclusion chromatography不同组份在固定相的吸附作用不同不同组份在固定相的吸附作用不同不同组份在固定相上的溶解能力不同不同组份在固定相上的溶解能力不同不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同不同尺寸分子在固定相上的渗透作用不同尺寸分子在固定相上的渗透作用3.3.固定相的使用的形式分类固定相的使用的形式分类柱色谱柱色谱 column chromatography平面色谱平面色谱 plane chromatography纸色谱法纸色谱法 paper chromatography薄层色谱法薄层色谱法 t
10、hin layer chromatography四、色谱法的特点四、色谱法的特点（1）分离效率高）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体，手性异构体。复杂混合物，有机同系物、异构体，手性异构体。（2）灵敏度高灵敏度高 可以检测出可以检测出g/g(10-6)级甚至级甚至ng/g(10-9)级的物质量。级的物质量。（3）分析速度快分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广应用范围广 气相色谱：沸点低于气相色谱：沸点低于350的各种有机或无机试样的分析。的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试
11、样的分离分析和制备。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析和制备。2.2 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语o一、色谱分离过程及流出曲线一、色谱分离过程及流出曲线o二、色谱相关术语二、色谱相关术语o三、色谱流出曲线的意义三、色谱流出曲线的意义一、色谱分离过程及流出曲线一、色谱分离过程及流出曲线1 1、色谱分离过程、色谱分离过程混合组分的分离过程及检混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段测器对各组份在不同阶段的响应的响应色谱分离基本原理：色谱分离基本原理：使用外力使含有样品的使用外力使含有样品的流动相流动相（气体、液体或超临（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上
12、、与流动相互不相界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的溶的固定相固定相表面。样品中各组份在两相中进行不同程表面。样品中各组份在两相中进行不同程度的度的作用作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个单组份的形成各个单组份的“带带(band)”或或“区区(zone)”，对依次，对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。流出的各个单组份物质可分别进行定
13、性、定量分析。由检测器输出的由检测器输出的信号强度信号强度对对时间时间作图，所得曲线即色谱作图，所得曲线即色谱流出曲线，也称色谱图流出曲线，也称色谱图。2 2、色谱流出曲线、色谱流出曲线1、色谱峰（、色谱峰（peak）：当某组分从色谱柱中流出时，检测器：当某组分从色谱柱中流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。2、基线（、基线（baseline）：在正常操作条件下（操作条件稳定后：在正常操作条件下（操作条件稳定后），仅有流动相通过检测器时，仪器记录到的一条平行于横），仅有流动相通过检测器时，仪器记录到的一条平行于横轴的直线。图中
14、轴的直线。图中CD所示。所示。2)基线漂移基线漂移（baseline drift）：）：基线随时间定向的缓慢变化。基线随时间定向的缓慢变化。1)基线噪声基线噪声（baseline noise）：）：由各种因素引起的基线起伏。由各种因素引起的基线起伏。3、峰高（、峰高（peak height）：）：色谱峰顶点与基色谱峰顶点与基线的距离。以线的距离。以h表示，图中表示，图中AB。二、色谱相关术语二、色谱相关术语1)标准偏差（标准偏差（standard deviation）：0.607倍峰高倍峰高处色谱峰宽度的一半处色谱峰宽度的一半，图中，图中EF的一半的一半。2)半峰宽（半峰宽（peak widt
15、h at half-height）Y1/2：峰高一峰高一半处的峰宽，图中半处的峰宽，图中GH。Y1/2=2.35 3)峰底宽峰底宽(peak width at peak base)Y：色谱峰两侧：色谱峰两侧拐点上切线在基线上的截距，图中拐点上切线在基线上的截距，图中IJ。Y=4 4、区域宽度、区域宽度（peak width）：）：用于衡量柱效及反映色谱用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：通常表示区域通常表示区域宽度宽度MtLu死时间柱长1）死时间死时间(dead time)tM：不被固定相吸附或溶解的组分（如空：不被固定
16、相吸附或溶解的组分（如空气、甲烷）从进样到出现其色谱蜂最大值所需的时间，图中气、甲烷）从进样到出现其色谱蜂最大值所需的时间，图中OA所示。所示。tM也是也是流动相流经色谱柱所需的时间流动相流经色谱柱所需的时间。据。据 tM 可求出可求出流动相平均流速流动相平均流速5、保留值、保留值R（retention value）：是试样各组分在色谱柱中是试样各组分在色谱柱中滞留时间的数值，它滞留时间的数值，它反映组分与固定相间作用力大小反映组分与固定相间作用力大小，通，通常用常用保留时间保留时间和和保留体积保留体积表示。表示。它是色谱定性分析和色谱它是色谱定性分析和色谱过程热力学特性的重要参数。过程热力学特性的重要参数。3）调整保留时间调整保留时间(adjusted retention time)t R：扣除死时间：扣除死时间后的保留时间，它是组分在固定相中的滞留时间。图后的保留时间，它是组分在固定相中的滞留时间。图中中AB所示，即所示，即t R=tR tM t R 反映了组分在色谱过程中，与固定相相互作用所消耗的反映了组分在色谱过程中，与固定相相互作用所消耗的时间，是各组分产生时间，是各组分产生
