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1、第三章第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法色谱法一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典经典LC：仅做为一种分离手段：仅做为一种分离手段 柱内径柱内径13cm，固定相粒径，固定相粒径100m 且不均匀且不均匀 常压输送流动相常压输送流动相 柱效低（柱效低（H，n）分析周期长分析周期长 无法在线检测无法在线检测2HPLC：分离和分析：分离和分析
2、柱内径柱内径26mm，固定相粒径，固定相粒径10m（球形（球形,均匀装柱）均匀装柱）高压输送流动相高压输送流动相 柱效高（柱效高（H，n）分析时间大大缩短分析时间大大缩短 可以在线检测可以在线检测二、二、HPLCHPLC与与GCGC差别差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测离子型及高聚
3、物的样品不可检测 占有机物的占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制 相对分子质量大、难气化、热稳定性差及高分子相对分子质量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%2流动相差别流动相差别vGC：流动相为惰性气体：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、流动相与组分间有亲合作用力，为
4、提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相极性和流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性3操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）提高柱内填料装填的均匀性提高柱内填料装填的均匀性,减小粒度减小粒度三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图
5、灵敏度高，重复性好灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体、线性范围宽、死体积小以及对温度和流积小以及对温度和流量的变化不敏感量的变化不敏感高效液相色谱仪的色谱柱高效液相色谱仪的色谱柱4.6mm或或3.9mm球形填料球形填料不规则形填料不规则形填料510m空柱管空柱管:200-300:200-300元元国产填料国产填料 国产装填国产装填 =800-1000=800-1000 元元进口填料进口填料 国产装填国产装填 =1200-1500=1200-1500 元元原装原装 进口柱进口柱 =2400-3000=2400-3000 元元HPLC 柱柱 =空柱管空柱管 +填料填料(分离介质分离介质)价格价格
6、?高效液相色谱仪的生产厂家高效液相色谱仪的生产厂家WatersAgillentShimadzPerkin ElmerVarian大连依利特公司大连依利特公司北京东西电子研究所北京东西电子研究所高效液相色谱仪高效液相色谱仪LC-2010HT岛津（香港）有限公司岛津（香港）有限公司新一代液相色谱 Alliance产品名称：液相色谱仪器大连依利特返回四、四、HPLCHPLC的特点和应用的特点和应用 “三高三高”“一快一快”“一广一广”HPLC应用应用医药方面：医药方面：生物组织生物组织 、血样、尿样分析，药剂组、血样、尿样分析，药剂组 分测定，药物生产控分测定，药物生产控 制，药代研究。制，药代研究
7、。生化方面：生化方面：主要用于氨基酸、蛋白质、酶、糠尿。主要用于氨基酸、蛋白质、酶、糠尿。食品方面：食品方面：果汁，饮料，酒类等中的添加剂。果汁，饮料，酒类等中的添加剂。环境方面：环境方面：饮用水，废水中质量标准的控制。饮用水，废水中质量标准的控制。大气、土壤污染研究大气、土壤污染研究一一.生物样品的分析生物样品的分析 正常对照组正常对照组Fig 2 (control group)诱导后诱导后3天组天组(Hydrocephalus ofthe3day)诱导后诱导后8天组天组(Hydrocephalus of the 8day)诱导后诱导后4月组月组(Hydrocephalus of the 4
8、 month)狗脑积水不同时期脑组织中肌酸、磷酸肌酸及磷酸腺苷酸的含量变化狗脑积水不同时期脑组织中肌酸、磷酸肌酸及磷酸腺苷酸的含量变化CrCrCrCrpCrCrpCrpAMPAMPAMPAMPADPADPCrpADPATPATPATPATPADPHPLCHPLC法分析心脏衰竭过程中黄连素对心脏法分析心脏衰竭过程中黄连素对心脏能量的保护作用能量的保护作用 标准色谱图标准色谱图 心肌样品色谱图心肌样品色谱图CrCrpAMPAMPCrCrpADPADPATPATP标准品色谱图标准品色谱图 对照组色谱图对照组色谱图 FDPFDP组色谱图组色谱图CrpCrpCrpATPATPATPHPLCHPLC法分析
9、人的心脏换瓣术中法分析人的心脏换瓣术中1 1，6-6-二磷酸果糖二磷酸果糖 对高能磷酸复合物含量的影响对高能磷酸复合物含量的影响HPLC法分析大鼠脑缺血再灌注后肌酸、腺苷和三磷法分析大鼠脑缺血再灌注后肌酸、腺苷和三磷酸腺苷的含量变化酸腺苷的含量变化 标准色谱图标准色谱图 脑组织样色谱图脑组织样色谱图ATPATPADOADOCrCrHPLC法分析经缺血预处理后大鼠移植肝脏中法分析经缺血预处理后大鼠移植肝脏中三磷酸腺苷的含量变化三磷酸腺苷的含量变化 肝组织样色谱图肝组织样色谱图 标准色谱图标准色谱图ATPAMPAMPATPADPADP 健康人空白血清色谱图健康人空白血清色谱图 给药后人血清色谱图给
10、药后人血清色谱图HPLCHPLC法测定健康人血清中的头孢唑啉法测定健康人血清中的头孢唑啉(CEZ)(CEZ)CEZHPLC法测定肺癌患者血清中维生素法测定肺癌患者血清中维生素A、维生素、维生素E番茄红素、番茄红素、-胡萝卜素胡萝卜素 标准色谱图标准色谱图 血清样色谱图血清样色谱图VAVAVEVELLHPLC法测定中草药提取物中紫杉醇的含量对照品色谱图对照品色谱图样品色谱图样品色谱图紫杉醇紫杉醇紫杉醇紫杉醇12345 大鼠尿中大鼠尿中83-1除草剂及其代谢产物的除草剂及其代谢产物的HPLC分离图分离图 空白尿样空白尿样 染毒尿样染毒尿样*1 大鼠肝微粒体中叶枯灵及其代射产物分离的大鼠肝微粒体中叶
11、枯灵及其代射产物分离的HPLC色谱图色谱图aba.对照组对照组 b.样品组样品组大鼠肝灌流中叶枯灵、代谢产物及其内标的色谱图大鼠肝灌流中叶枯灵、代谢产物及其内标的色谱图(7)*二、二、食品、药物的分析食品、药物的分析13231135554蕹菜蕹菜 冬苋菜冬苋菜 对照品对照品 HPLC法测定法测定9种蔬菜中的类胡萝卜素种蔬菜中的类胡萝卜素HPLC法测定中药辛弗林的含量标准品色谱图 样品色谱图辛弗林辛弗林辛弗林辛弗林HPLC法测定血清中延胡乙素的血药浓度样品色谱图样品色谱图对照品色谱图对照品色谱图延胡乙素延胡乙素延胡乙素延胡乙素对照品色谱图对照品色谱图样品色谱图样品色谱图HPLCHPLC分析银杏叶
12、提取物中懈皮素及总黄酮的含量懈皮素懈皮素懈皮素懈皮素山萘酚山萘酚异鼠李素异鼠李素MECC分离中药黄芩中六种黄酮类成份分离中药黄芩中六种黄酮类成份P106：解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相 相互作用力相互作用力的差别进行分离的。的差别进行分离的。从仪器构造上看，从仪器构造上看，液相色谱液相色谱需要增加高压泵以提高流动需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器气相
13、色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MSMS等联等联用。用。二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用于用于HPLCHPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。量大的限制。
