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1、1第五章第五章 表达载体表达载体第一节第一节 大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体 第二节第二节 穿梭载体穿梭载体第三节第三节 整合载体整合载体2一、大肠杆菌表达载体的结构一、大肠杆菌表达载体的结构原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。加表达元件。1 1、表达元件、表达元件(expression elements)(expression elements)：1 1）启动子）启动子(promoter)(promoter)
2、：三类，即：三类，即laclac启动子、启动子、trptrp启动子和它们的杂合启动子启动子和它们的杂合启动子tactac或或trctrc，都受，都受IPTGIPTG诱导。诱导。T T7 7噬菌体启动子噬菌体启动子噬菌体的噬菌体的P PL L启动子。启动子。第一节第一节 大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体32）终止子：依赖于）终止子：依赖于因子或不依赖于因子或不依赖于因子（遇茎环结构因子（遇茎环结构而终止）。而终止）。3 3）核糖体结合位点）核糖体结合位点(ribosome binding side,RBS)(ribosome binding side,RBS)：Shine-Dalgarno(Sh
3、ine-Dalgarno(SD)序列，序列，ATG与与RBS之间的距离很重要，之间的距离很重要，一般一般3-11bp。2、表达形式、表达形式完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。融合蛋白融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶了一个多酶复合体一样，可减
4、少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。连两个或多个相关基因的表达。43、表达的控制、表达的控制诱导表达系统：诱导表达系统：IPTG防渗漏表达系统：防渗漏表达系统：lacIqPL启动子受启动子受c的调控，低温的调控，低温(30)下阻抑转录，下阻抑转录，高温高温(40-45)下解除抑制。下解除抑制。二、利用二、利用T7噬菌体启动子的表达载体噬菌体启动子的表达载体pET系列，表达能力强，可控性好，只受系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬噬菌体菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚聚合酶识别，可用合酶识别，可用IPTG诱导表达。诱导表达。5非融合型表达载体
5、非融合型表达载体 主要元件主要元件：强启动子、：强启动子、SD、起始密码子、起始密码子ATG、万能、万能终止密码子。终止密码子。PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因6非融合型表达载体非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子启动子-温度诱导温度诱导插入位点插入位点-HpaI7三、表达融合蛋白的表达载体三、表达融合蛋白的表达载体1 1、GST(glutahione S-transferase,GST(glutahione S-transferase,谷胱苷肽谷胱苷肽S-S-转移酶转移酶)表达载体：如表达载体：如AmershammAmershamm公
6、司的公司的pGEXpGEX系列，系列，其其GSTGST来自于血吸早虫，融合蛋白下保持酶学活来自于血吸早虫，融合蛋白下保持酶学活性，对谷胱苷肽有很强的结合能力，融合蛋白纯性，对谷胱苷肽有很强的结合能力，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。2 2、组氨酸标签表达载体：如、组氨酸标签表达载体：如NovagenNovagen公司的公司的pETpET系系列，可在目标蛋白的列，可在目标蛋白的N-N-端或端或C-C-端加上端加上6 6个组氨酸个组氨酸的标签和的标签和XaXa因子酶工位点，能与镍等二价金属离因子酶工位点，能与镍等二价金属离子结合，纯
7、化目的蛋白，用子结合，纯化目的蛋白，用XaXa因子处理可得到纯因子处理可得到纯的目的蛋白。的目的蛋白。83 3、内含肽表达载体：如、内含肽表达载体：如NEBNEB公司的公司的Impact-TwinImpact-Twin系系统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽(intein)(intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶消解、只需要调节酶消解、只需要调节pHpH值等条件就将标签蛋白切值等条件就将标签蛋白切除。除。4 4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋
8、白酶的降解，或使其正确折叠，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除或去除N-N-端甲硫氨酸，以维护活性。端甲硫氨酸，以维护活性。信号肽信号肽(signal peptide)(signal peptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋有碱性磷酸酶信号肽、蛋白质白质A A信号肽（如信号肽（如AmershamAmersham公司的公司的pEZZ18pEZZ18系统）。系统）。9 融合型表达载体融合型表达载体PSDForeign DNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因10技术关键技术关键：克隆基因可插入标签肽序列：克隆基因可插入标签肽序列的的3 3或或5 5端，但必须维持正确的端，但
9、必须维持正确的ORFORF。选择合适酶切位点选择合适酶切位点 加人工合成的加人工合成的DNA接头接头 构建位相载体构建位相载体11-ATG-AAC CTG GAA TTC CTA GGT-TAC-TTG GAC CTT AAG GAT CCA-EcoRIBamHIAAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGTTTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA 载体部分序列载体部分序列DNA序列序列12位相载体位相载体-含有含有3种读码框的系列载体种读码框的系列载体13优点：优点：表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可易鉴定：融合蛋白分
10、子量大，电泳可鉴定鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性14Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物，切割方便：产物，切割方便：pGEX-1 T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因子位相载体位相载体融合型载体融合型载体-pGEX系列系列15分泌型融合表达载体分泌型融合表达载体-pEZZ1816分泌型表达载体分泌型表达载体-pINIII-ompA117四、表达产物的纯化四、表达产物的纯化1 1、包涵体、包涵体(inclusion body)(inclusion body)的纯化：许多情况下表达产物的纯化：许多情
11、况下表达产物在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除杂蛋白，用盐酸胍、尿素和杂蛋白，用盐酸胍、尿素和SDSSDS溶解包涵体，再通过一定溶解包涵体，再通过一定的法使蛋白质折叠。的法使蛋白质折叠。有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后就没有活性了，但可作为抗原。就没有活性了，但可作为抗原。2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内呈可溶状态，、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以
12、细胞内呈可溶状态，也有少量进入细胞周质区。将细胞裂解物的上清部分用于也有少量进入细胞周质区。将细胞裂解物的上清部分用于纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。18穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)(shuttle vector)：能够在两类不同的宿：能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的载体，主要是质粒，它主中复制、增殖和选择的载体，主要是质粒，它们至少有两套复制单元和两套选择标记，相当于们至少有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。两个载体的联合。只要涉及大肠杆菌以外的细胞，绝大多数载体都装只要涉及大肠杆菌以
13、外的细胞，绝大多数载体都装有大肠杆菌质粒载体的基本元件，都可看作穿梭有大肠杆菌质粒载体的基本元件，都可看作穿梭载体。载体。第二节第二节 穿梭载体穿梭载体19一、大肠杆菌一、大肠杆菌/革兰氏阳性菌穿梭载体：如向枯草芽革兰氏阳性菌穿梭载体：如向枯草芽孢杆菌的穿梭。孢杆菌的穿梭。二、大肠杆菌二、大肠杆菌/酵母菌穿梭载体：主要用于遗传学和酵母菌穿梭载体：主要用于遗传学和真核表达研究，尤其是当蛋白需要进行真核修饰真核表达研究，尤其是当蛋白需要进行真核修饰时，如磷酸化、糖基化等。时，如磷酸化、糖基化等。三、其它穿梭载体：如动物病毒载体、植物转化的三、其它穿梭载体：如动物病毒载体、植物转化的TiTi质粒、昆
14、虫杆状病毒等，更为复杂一些。质粒、昆虫杆状病毒等，更为复杂一些。2021整合载体整合载体(integration vector)(integration vector)：用于将某个基因：用于将某个基因或某些基因插入到宿主的染色体中去工作，按整或某些基因插入到宿主的染色体中去工作，按整合方式可分为定点整合和随机整合两类，按作用合方式可分为定点整合和随机整合两类，按作用可分为目的基因的插入可分为目的基因的插入/敲除或随机突变体库的敲除或随机突变体库的构建。构建。一、基因插入一、基因插入/基因敲除基因敲除同源重组整合载体最为常用，不仅含有大肠杆菌克同源重组整合载体最为常用，不仅含有大肠杆菌克隆载体的
15、骨架，还有一段便于同源重组的重组隆载体的骨架，还有一段便于同源重组的重组DNADNA片段。片段。第三节第三节 整合整合载体载体22二、随机插入突变载体二、随机插入突变载体用于功能基因组研究中基因突变材料的创造。用于功能基因组研究中基因突变材料的创造。随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过DNADNA重组事重组事件随机插入到基因组中而形成的众多基因突变体的集合。件随机插入到基因组中而形成的众多基因突变体的集合。1 1、微生物插入突变体库：如、微生物插入突变体库：如pEG922pEG922，需要借助转座子。，需要借助转座子。2 2、构建植物突变体库所用
16、的载体：、构建植物突变体库所用的载体：根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens)介导的介导的T-DNAT-DNA插入插入或植物转座子或植物转座子(transposon)(transposon)标签是植物基因功能研究中常标签是植物基因功能研究中常用的产生突变体的方法用的产生突变体的方法231 1）T-DNAT-DNA插入突变体：植物转基因过程中插入突变体：植物转基因过程中T-DNAT-DNA区区段如果插入到一个功能基因中，会导致该基因插段如果插入到一个功能基因中，会导致该基因插入失活而产生性状变化，形成突变体。入失活而产生性状变化，形成突变体。还可以在还可以在T-DNAT-DNA区段构建基因激活标签、基因陷阱区段构建基因激活标签、基因陷阱(gene trap)(gene trap)、启动子陷阱、启动子陷阱(promoter trap)(promoter trap)或增或增强子陷阱强子陷阱(enhancer trap)(enhancer trap)，用于直接克隆靶基，用于直接克隆靶基因编码区、启动子、增强子等
