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1、第第 六六 章章 基因操作中大分子的分离和分析基因操作中大分子的分离和分析第一节第一节 DNADNA的分离、检测和纯化的分离、检测和纯化第二节第二节 RNARNA的分离、检测和纯化的分离、检测和纯化第三节第三节 分子杂交分子杂交第四节第四节 RNARNA作图和端点分析作图和端点分析第五节第五节 重组重组DNADNA分子导入大肠杆菌分子导入大肠杆菌第一节第一节 DNA的分离、检测和纯化一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化二、DNA的琼脂糖凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳四、脉冲场凝胶电泳四、脉冲场凝胶电泳五、五、DNADNA片段的纯化片段的纯化天然天然DNADNA来源来源:染色
2、体染色体DNA。病毒和噬菌体病毒和噬菌体DNA。质粒质粒DNA。线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体DNA。一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化 分离质粒分离质粒DNA的方法众多，的方法众多，其依据其依据是利用分子大小不同、碱基组成的差异是利用分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行分离。目前常用的有碱构的特点来进行分离。目前常用的有碱裂解法、煮沸法、去污剂裂解法、煮沸法、去污剂(如如Triton或或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱层析法、质裂解法、羧基磷灰石柱层析法、质粒粒DNA释放法、酸酚法等。释放法、酸酚法等。1 碱裂解法提取大肠杆菌
3、质粒DNA原理 碱裂解法碱裂解法由由BirnboimBirnboim和和DolyDoly设计并于设计并于19791979年年发表，基于染色体发表，基于染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA变性与复变性与复性的差异而达到分离目的。性的差异而达到分离目的。在在pHpH高达高达12.512.5的碱性条件下，染色体的碱性条件下，染色体DNADNA的的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNADNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。合环状的两条互补链不会完全分离。当以当以pH4.6pH4.6的的KA
4、cKAc高盐缓冲液调节其高盐缓冲液调节其pHpH至至中性时，变性的质粒中性时，变性的质粒DNADNA又恢复原来的构又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体型，保存在溶液中，而染色体DNADNA不能复不能复性而形成缠连的网状结构。性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体通过离心，染色体DNADNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNARNA、蛋白质、蛋白质-SDS-SDS复合物等一起沉淀下来复合物等一起沉淀下来而被除去。而被除去。碱抽提法所用试剂的生化作用碱抽提法所用试剂的生化作用 提取过程提取过程中所用的材料有中所用的材料有LBLB培养基、葡萄糖培养基、葡萄糖/Tris/EDTA/Tris/E
5、DTA溶液溶液(5Ommol/L(5Ommol/L葡萄糖；葡萄糖；25mmol/L 25mmol/L TrisHClTrisHCl；pH8.0pH8.0，lOmmol/L EDTA)lOmmol/L EDTA)、TETE缓冲缓冲液、液、3mol/L3mol/L乙酸钾溶液、乙酸钾溶液、NaOH-SDSNaOH-SDS溶液、溶溶液、溶菌酶液、异丙醇、菌酶液、异丙醇、100%100%乙醇和乙醇和70%70%乙醇等。乙醇等。溶菌酶溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1-1，4 4糖苷键，因而具有溶菌作用。糖苷键，
6、因而具有溶菌作用。葡萄糖葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止压，防止DNADNA受机械剪切力作用而降解。受机械剪切力作用而降解。EDTA:EDTA:EDTAEDTA螯合螯合MgMg2+2+和和CaCa2+2+等金属离子，等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对抑制脱氧核糖核酸酶对DNADNA的降解作用的降解作用,同时有利于溶菌酶的作用。同时有利于溶菌酶的作用。NaOH-SDSNaOH-SDS液液:NaOHNaOH浓度为浓度为0.2 mol/L0.2 mol/L，加，加抽提液时，该系统的抽提液时，该系统的pHpH就高达就高达12.612.6，因，因而促使染色体而促使染
7、色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA的变性。的变性。SDSSDS是是离子型表面活性剂，它可以溶解细离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为能与蛋白质结合成为R-O-S0R-O-S03 3-RR+一蛋白一蛋白质的复合物质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。使蛋白质变性沉淀下来。KAc:KAc:pH4.8pH4.8的的KAcKAc溶液是为了把溶液是为了把pHl2.6pHl2.6的的抽提液调节至中性，使变性的质粒抽提液调节至中性，使变性的质粒DNADNA能能
8、够复性，并能稳定存在。够复性，并能稳定存在。高盐高盐3mol/L KAc3mol/L KAc有利于变性的大分子染有利于变性的大分子染色体色体DNADNA、RNARNA以及以及SDS-SDS-蛋白复合物的凝蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体聚而沉淀。染色体DNADNA因为中和了核酸上因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与与RNARNA、SDS-SDS-蛋白复合物作用后，形成钾蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。盐形式复合物，使沉淀更完全。无水乙醇无水乙醇:沉淀沉淀DNADNA，它的优点是可以任，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与
9、核酸不会意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对起任何化学反应，对DNADNA很安全。很安全。DNADNA溶溶液是液是DNADNA以水合状态稳定存在，当加入乙以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去醇时，乙醇会夺去DNADNA周围的水分子，使周围的水分子，使DNADNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。酚酚-氯仿氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过
10、离心，变性蛋白质的密度比变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的水相下面，从而与溶解在水相中的DNADNA分分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。留在最下层。异戊醇异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。持稳定。2023-11-
11、7162 通过试剂盒分离纯化大肠杆菌质粒DNA 二、DNA的琼脂糖凝胶电泳1、凝胶电泳的基本原理一种分子被放置到电场中，它就会以一定的一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。泳迁移率。2、影响电泳迁移速率的因
12、素：、影响电泳迁移速率的因素：1）分子筛效应分子筛效应DNA分子在凝胶介质中泳动时有分子在凝胶介质中泳动时有电荷效应电荷效应和和分子筛效应分子筛效应。DNA分子在高于等电点的分子在高于等电点的pH溶溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决分子的迁移速度取决于分子筛效应，即于分子筛
13、效应，即DNA分子本身的大小和构分子本身的大小和构型。型。2）相对分子质量）相对分子质量具有具有不同的相对分子质量不同的相对分子质量的的DNA片段泳动速片段泳动速度不一样，可进行分离。度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。值成反比关系。DNA样品与已知相对分子质量大小的标准样品与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。就可获知该样品的相对分子质量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DN
14、A，也可以鉴别相对分子质量相同但构型，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的不同的DNA分子。分子。3）构型）构型在抽提质粒在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影过程中，由于各种因素的影响，使响，使超螺旋超螺旋(SC)的共价闭合环状的共价闭合环状(CCC)结结构的质粒构的质粒DNA的一条链断裂，变成的一条链断裂，变成开环状开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就转变为分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状线状(L)分子。这分子。这3种构型的分子有不同的迁种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状度
15、最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。当提取到的质粒分子。当提取到的质粒DNA样品中还有染色样品中还有染色体体DNA或或RNA时，在凝胶电泳上也可以分别时，在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。3、DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳1）DNA的显示原理：的显示原理：制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化乙锭乙锭(EB)在紫外光照射下能发射在紫外光照射下能发射桔红色的荧光桔红色的荧光。当。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入就
16、插入DNA分子中形成荧光络合物，使分子中形成荧光络合物，使DNA发发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，只需要描仪检测，只需要5 5lOlOng DNA，就可以从照片上，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.010.1gg的的DNA。2）影响电泳迁移的主要因素：DNADNA的大小的大小DNADNA的构象的构象琼脂糖浓度琼脂糖浓度缓冲液：缓冲液：乙酸盐缓冲液乙酸盐缓冲液(TAE)(TAE)、硼、硼酸盐缓冲液酸盐缓冲液(TBE)(TBE)、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(TPE)(TPE)。不同构像质粒不同构像质粒分离不同大小分离不同大小DNADNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度片段的合适琼脂糖凝胶浓度3）琼脂糖凝胶电泳的操作过程）琼脂糖凝胶电泳的操作过程A、缓冲液制备缓冲液制备B、EB母液配制：母液配制：10mg/ml，在
