第7章亲和层析.ppt

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1、2023-11-7第七章第七章 亲和层析亲和层析Affinity chromatographywss22023-11-7技术背景技术背景n各种大分子物质之间理化特性的差异性。各种大分子物质之间理化特性的差异性。n但如果这种差异性较小，纯化较麻烦，最终收得但如果这种差异性较小，纯化较麻烦，最终收得率很低。率很低。wss32023-11-7内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 操作操作第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量第四节第四节 应用实例应用实例wss42023-11-7第一节第一节 基本原理基本原理蛋白质蛋白质2 2与配体无与配体无生物学特异性生物学特

2、异性L LMMS Swss52023-11-7一、亲和层析的概念一、亲和层析的概念n亲和力亲和力n 根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子子特异识别和可逆结合特异识别和可逆结合的特征，将生物分子间的这种结的特征，将生物分子间的这种结合能力称为亲和力。合能力称为亲和力。wss62023-11-7n亲和层析法亲和层析法n 利用生物大利用生物大分子和固定相表分子和固定相表面存在某种面存在某种特异特异性吸附性吸附而进行选而进行选择性分离的一种择性分离的一种生物大分子分离生物大分子分离的层析方法。的层析方法。wss72023-11-7n亲和层析法的实质

3、亲和层析法的实质n 是在载体是在载体(无机或有机填料无机或有机填料)的表面先键和一种具有的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、一般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相激素等）组成固定相,配体配体高选择地吸附与其有生物特高选择地吸附与其有生物特性的大分子性的大分子而被保留而被保留,非特异的分子不被保留先流出层非特异的分子不被保留先流出层析柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。析柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。wss82023-11-7wss92023-11-7wss102023-11-7wss112023-11-7 二、二、亲

4、亲和和层层析法的作用析法的作用机机理理固相固相载体载体(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB亲亲和基和基团团配配体体XBAAwss122023-11-7wss132023-11-7n特异性配体亲和层析法和特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和通用性配体亲和层层析法：析法：方法方法配体配体性能性能特异性配体亲和特异性配体亲和层析法层析法复杂的生命大分子复杂的生命大分子物质（如抗体、受物质（如抗体、受体和酶的类似底物体和酶的类似底物等）等）具有较强的吸附选具有较强的吸附选择性和较大的结合择性和较大的结合力力通用性配体亲和通用性配体亲和层析法层析法简单的小分子物质简单的小分

5、子物质（如金属、染料、（如金属、染料、以及氨基酸等）以及氨基酸等）成本低廉，具有较成本低廉，具有较高的吸附容量，通高的吸附容量，通过改善吸附和脱附过改善吸附和脱附条件可提高层析的条件可提高层析的分辨率分辨率wss142023-11-7三、亲和层析具备的三要素三、亲和层析具备的三要素n介质介质(基质基质)具有活化基团具有活化基团n间隔臂 连接介质与配体的分子n配体配体 具有识别能力具有识别能力n反配体（分离物）反配体（分离物）与配体进行可逆结合与配体进行可逆结合wss152023-11-7 四、四、亲亲和和层层析法的四要析法的四要点点(2)SpecificBindingSubstance(S)溶

6、溶 解解Elution(4)配配 体体Ligand(L)偶偶合反合反应应 (3)Coupling Reaction杂杂 质质SSSS(1)Solid MatrixSwss162023-11-7五、亲和层析的特点五、亲和层析的特点n条件温和：条件温和：不影响样品的生物活性，适合生物大不影响样品的生物活性，适合生物大分子的操作。分子的操作。n纯化效率高：纯化效率高：一步法分离和纯化混合物中的样品，一步法分离和纯化混合物中的样品，提纯达几千倍提纯达几千倍,得到高纯度样品。得到高纯度样品。n选择性强：选择性强：依据生物学特异性，而非物理化学性依据生物学特异性，而非物理化学性质分离原理。故特异的质分离原

7、理。故特异的层析图为层析图为2 2个峰个峰，第，第1 1个为个为杂峰，第杂峰，第2 2峰为纯品。峰为纯品。wss172023-11-7Activity 典型的典型的亲亲和和层层析操作：析操作：Elution volumeProteinpH 2.05*wss182023-11-7五、亲和层析的特点五、亲和层析的特点n柱层析柱小柱层析柱小 VtVt1 11.5ml1.5ml。上样量大。上样量大,达达 1/2Vt1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。体积并对样品的浓度与纯度要求不高。n操作简单，时间快速。操作简单，时间快速。n柱子填充载体昂贵，配体的特异性，有时找不柱子填充载体昂贵，配体的特异

8、性，有时找不到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。PriboFast黄曲霉毒黄曲霉毒素素B1免疫免疫层析亲和柱层析亲和柱 wss192023-11-7内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第二节 操作操作第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量第四节第四节 应用实例应用实例wss202023-11-7二、配基（配体）的选择二、配基（配体）的选择第二节第二节 操作操作 一、理想基质的性质一、理想基质的性质n优良的配体必须具备两个条件：优良的配体必须具备两个条件：n配体与生物大分子具有合适的亲和力；配体与生物大分子具有合适的亲和

9、力；n配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生物大分子之间的亲和力。物大分子之间的亲和力。wss212023-11-7常用配体常用配体分离对象分离对象酶蛋白酶蛋白基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等抗抗 体体抗原、病毒、细胞抗原、病毒、细胞外源凝集素外源凝集素多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白核核 酸酸互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白蛋白激素及维生素激素及维生素受体、载体蛋白受体、载体蛋白细细 胞胞细胞表面特异性蛋白、外源凝集素细胞表

10、面特异性蛋白、外源凝集素专一性结合的生物体系专一性结合的生物体系wss222023-11-7配体配体待纯化的蛋白质待纯化的蛋白质配体配体待纯化的蛋白质待纯化的蛋白质抗原抗原特定单克隆抗体或多特定单克隆抗体或多克隆抗体克隆抗体肝素肝素凝聚因子、脂酶、结缔凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、组织蛋白酶、DNADNA聚合聚合酶酶单克隆抗体单克隆抗体特定抗原特定抗原胆固醇胆固醇胆固醇受体、胆固醇结胆固醇受体、胆固醇结合蛋白合蛋白蛋白质蛋白质A/A/蛋白蛋白质质G G免疫球蛋白免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸脂肪酸结合蛋白、白蛋脂肪酸结合蛋白、白蛋白白蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶蛋白酶核苷酸核苷酸核苷酸结合蛋白、需

11、核核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶苷酸的酶磷酸磷酸磷酸酶磷酸酶苯基硼酸苯基硼酸盐盐糖蛋白糖蛋白三嗪染料三嗪染料脱氢酶、激酶、聚合脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素酶、限制酶、干扰素凝集素凝集素糖蛋白糖蛋白抗生物素蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶含生物素的酶糖糖凝集素、糖苷酶凝集素、糖苷酶蛋白质亲和层析中的合适配体蛋白质亲和层析中的合适配体wss232023-11-7三、亲和吸附剂的制备三、亲和吸附剂的制备n载体的活化载体的活化（CNBrCNBr）n配体的偶联配体的偶联n结合能力的测定结合能力的测定用溴化氰活化载体用溴化氰活化载体wss242023-11-7wss252023-11-7四、四、特异性吸

12、附特异性吸附 欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加强时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成入，亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱致密的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影响吸附容量除亲和力外和还与和。影响吸附容量除亲和力外和还与pHpH、离子强、离子强度有关。度有关。复合物带复合物带 wss262023-11-7 样品中有效成分样品中有效成分在亲和吸附剂上的在亲和吸附剂上的吸附量，除了与它吸附量，除了与它们之间的亲和力

13、有们之间的亲和力有密切关系外，还与密切关系外，还与样品的样品的pHpH值和离子值和离子强度强度有关系。有关系。wss272023-11-7五、层析步骤五、层析步骤n样品制备样品制备 结合步骤结合步骤 装柱操作装柱操作n流速控制流速控制 洗脱方法洗脱方法 淋洗淋洗n洗脱目标样品洗脱目标样品 柱子再生柱子再生选择配体选择配体凝胶与配体偶联凝胶与配体偶联柱子平衡柱子平衡wss282023-11-7洗脱方法洗脱方法wss292023-11-7A.特异性洗脱：特异性洗脱：凡是能与配体竞争酶的游离配体，都十分强烈凡是能与配体竞争酶的游离配体，都十分强烈地影响着结合酶的洗脱过程。游离配体浓度若与地影响着结合

14、酶的洗脱过程。游离配体浓度若与配体浓度相同，则可直接从基质上洗脱小结合的配体浓度相同，则可直接从基质上洗脱小结合的酶。同时应根据酶与配体亲和力的大小确定洗脱酶。同时应根据酶与配体亲和力的大小确定洗脱液的浓度。液的浓度。B.非特异性洗脱：非特异性洗脱：通过改变洗脱液的条件（通过改变洗脱液的条件（pHpH、离子强度、温度、离子强度、温度和介电常数），即能改变蛋白质的构象，降低蛋和介电常数），即能改变蛋白质的构象，降低蛋白质与配体的亲和力、不损害蛋白质与吸附剂的白质与配体的亲和力、不损害蛋白质与吸附剂的稳定性。稳定性。wss302023-11-7内容提要内容提要第一节第一节 基本原理基本原理第二节第

15、二节 操作操作第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量第四节第四节 应用实例应用实例wss312023-11-7第三节第三节 提高吸附剂的操作容量提高吸附剂的操作容量亲和吸附剂的操作容量，受以下因素的影响：亲和吸附剂的操作容量，受以下因素的影响：l 配体性质配体性质l 配体在吸附剂中的含量配体在吸附剂中的含量l 配体与吸附物结合时的位阻效应大小配体与吸附物结合时的位阻效应大小l 基质的多孔性基质的多孔性l 操作条件等操作条件等wss322023-11-7一、引入间隔手臂一、引入间隔手臂小分子配体直接连接于琼脂糖上会产生无效吸附，小分子配体直接连接于琼脂糖上会产生无效吸附，其原因是

16、由于载体的空间位阻关系，使大分子化合其原因是由于载体的空间位阻关系，使大分子化合物（亲和物）不物（亲和物）不能直接接触到配能直接接触到配体。因此，通过在体。因此，通过在载体与配体之间引载体与配体之间引入适当长度的入适当长度的“手手臂臂”减少载体的空减少载体的空间位阻，增加配间位阻，增加配体的活动度。体的活动度。wss332023-11-7对氨基苯对氨基苯-硫代吡喃半乳糖苷硫代吡喃半乳糖苷氨乙基乙酰胺氨乙基乙酰胺常见的间隔臂是常见的间隔臂是6 68 8个碳原子的碳氢链，基质到配个碳原子的碳氢链，基质到配体的长度为体的长度为0.50.51nm1nm；或用长达；或用长达1717个碳原子。个碳原子。间隔臂间隔臂:不同长度的间隔臂不同长度的间隔臂（B B1nm1nm），），(C=2.1nm)(C=2.1nm)对对靶酶的亲和力的差异。靶酶的亲和力的差异。wss342023-11-7二、增加配体取代的程度二、增加配体取代的程度n基质的活性基团增多，配体结合量增加，操作容量基质的活性基团增多，配体结合量增加，操作容量亦大；由于位阻效应而影响配体的偶联量，故控制亦大；由于位阻效应而影响配体的偶联量，故控