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1、第7章 蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小与形状二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定(Isolation,purification and characteristics of proteins)表征：事物显露在外的征象表征：事物显露在外的征象一、蛋白质的酸碱性质蛋白质的等电点和等离子点 对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白
2、质来说，在某一pH下，它所带的下，它所带的正电荷总数与负电荷总数刚好相等，这个正电荷总数与负电荷总数刚好相等，这个pH叫该蛋叫该蛋白质的等电点（白质的等电点（Isoelectric point）。）。在没有其它盐在没有其它盐类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出的质子数类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出的质子数与质子受体基团接受的质子数相等时的与质子受体基团接受的质子数相等时的pH叫该蛋白叫该蛋白质的等离子点（质的等离子点（isoionic point）。等离子点是蛋白）。等离子点是蛋白质的一个特征常数？质的一个特征常数？二、蛋白质分子的大小与形状根据化学组成测定最低分子量 用化学分析的方法测
3、出蛋白质中某一物质（原用化学分析的方法测出蛋白质中某一物质（原子）或某一含量很低的氨基酸残基的含量，并假设子）或某一含量很低的氨基酸残基的含量，并假设蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子，则可以蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子，则可以计算出该蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含计算出该蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含铁量为铁量为0.335%，其最低分子量可按下式算出：，其最低分子量可按下式算出：16700100335.08.55100335.0铁的原子量蛋白质的分子量%335.0%100铁的原子量蛋白质的分子量根据化学组成测定最低分子量 若蛋白质中含有若蛋白质中含有n个被测原子，则分子
4、量等于个被测原子，则分子量等于最低分子量最低分子量n.若蛋白质中某种氨基酸的含量特别低，通过若蛋白质中某种氨基酸的含量特别低，通过测定这种氨基酸的含量，也可用此法计算出蛋白测定这种氨基酸的含量，也可用此法计算出蛋白质的分子量。质的分子量。渗透压测定的示意图Vant Hoff 公式 在理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关在理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用系可用Vant Hoff公式表示：公式表示：VRTMgVnRTrrrMcRTMRTVg 式中式中是渗透压（是渗透压（N/m2，即，即Pa），），V是溶液的体是溶液的体积（积（m3），），n是溶液中溶质的摩尔数，是溶液中溶质的摩尔数，
5、g是溶质的质是溶质的质量（量（g），），c是溶质的浓度（是溶质的浓度（g/m3），），T是绝对温度是绝对温度（K），），R是气体常数（是气体常数（8.314J/Kmol），），Mr为溶质为溶质的分子量或摩尔质量（的分子量或摩尔质量（g/mol）。）。渗透压法测定蛋白质的分子量 在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。在溶质浓度不大时，它们的关系可用下式表示：在溶质浓度不大时，它们的关系可用下式表示：2KcMcRTrRTKcMRTcrcRTMcr0limRTKccR
6、TMr 当当c 趋向于趋向于0时，时，RTKc 趋向于趋向于0，但，但/c 不趋向于不趋向于0，而，而是趋向于一定值。是趋向于一定值。渗透压法测定蛋白质的分子量 测定几个不同浓度下的渗透压，以测定几个不同浓度下的渗透压，以/c对对c作图，作图，并外推至并外推至c为为0时的时的/c，再代入上式求得，再代入上式求得Mr。为了避免蛋白质带电荷引起其它无机离子分为了避免蛋白质带电荷引起其它无机离子分布不均匀对渗透压的影响，在溶解度许可的范围布不均匀对渗透压的影响，在溶解度许可的范围内，尽量采用等电点或接近于等电点的缓冲液作内，尽量采用等电点或接近于等电点的缓冲液作膜内外的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓
7、度。膜内外的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。沉降分析法测定蛋白质的分子量 用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量需要超速离心机，超速离心机的转速可以达到每需要超速离心机，超速离心机的转速可以达到每分钟分钟6万万8万转，这样高的转速使得被离心的分万转，这样高的转速使得被离心的分子受到的离心力达到子受到的离心力达到40万万70万万g。超速离心机工作原理制备型超速离心机制备型超速离心机分析型超速离心机分析型超速离心机被离心分子的受力分析沉降速度法 在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时，它将受在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时，它将受到三种力的作用：到三种力的作用
8、：xmFpc2)(离心力xvmxVFppb22)(浮力dtdxfvfFf)(摩擦力离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力：离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力：)1(222vxmxvmxmFFpppbc 式中式中m p是分子颗粒的质量（是分子颗粒的质量（g）；）；是转头的角是转头的角速度（速度（rad/s）；）；x是旋转轴心至界面的径向距离是旋转轴心至界面的径向距离（cm）；）；2 x是离心加速度；是离心加速度；V p是分子颗粒的体积；是分子颗粒的体积；是溶剂的密度（是溶剂的密度（g/cm3）；）；是蛋白质的偏微分比容是蛋白质的偏微分比容（偏微分比容：当加入（偏微分比容：当加入1g干物质到无
9、限大体积的溶干物质到无限大体积的溶剂中时，溶液体积的增量）；剂中时，溶液体积的增量）；V p或是被分子颗粒或是被分子颗粒排开的溶剂的质量；排开的溶剂的质量；f是摩擦系数；是摩擦系数；v是沉降速度，是沉降速度，即即dx/dt。v沉降速度法fFFFbcdtdxfvxmp)1(2fvmxdtdxp)1(2 当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力大小相等，方向相反：擦力大小相等，方向相反：即即整理得整理得 等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定值，等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定值，可见单位离心场的沉降速度是一个定值。将此定值称可见单位离心场的沉
10、降速度是一个定值。将此定值称为沉降系数（为沉降系数（sedimentation coefficient），用），用 s（小（小写）表示。写）表示。沉降速度法dtxddtxddtxdxxdtdxs2222log303.2ln 是是log x对对t t作图所得直线的斜率，因此测得在作图所得直线的斜率，因此测得在t t1,t2,t3,时间相应的时间相应的x x1,x2,x3,，作图求出斜率，作图求出斜率，代入上式即可求出沉降系数代入上式即可求出沉降系数 s，沉降系数的单位是，沉降系数的单位是秒。秒。dtxd log沉降速度法 蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系
11、数介于介于11013到到2001013秒之间。为了使用方秒之间。为了使用方便，以便，以1013秒为一个沉降系数的单位，称为斯维秒为一个沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（得贝格单位（Svedberg unit），或称沉降系数单），或称沉降系数单位，用位，用 S（大写）表示。如人血红蛋白的（大写）表示。如人血红蛋白的s为为4.461013秒，即秒，即4.46S。沉降速度法)()(,202020btpwwpbtbtwss 由于测定时温度和溶剂性质对由于测定时温度和溶剂性质对 s 值都有影响，需值都有影响，需要校正成标准条件下的要校正成标准条件下的 s 值，这样才便于比较。标准值，这样才便于比较。标
12、准条件是条件是20，溶剂是水。标准条件下的，溶剂是水。标准条件下的 s 值记为值记为s 20,w。校正公式如下：校正公式如下：由于蛋白质浓度增加，分子间可能彼此干扰，使由于蛋白质浓度增加，分子间可能彼此干扰，使得得 s 值减小。为排除因蛋白质浓度造成的测定误差，值减小。为排除因蛋白质浓度造成的测定误差，可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的 s 值，然后值，然后外推至浓度为外推至浓度为0时的时的s 20,w。蛋白质分子颗粒的质量蛋白质分子颗粒的质量 ，爱因斯坦萨，爱因斯坦萨德兰德方程：德兰德方程：。式中。式中M r 是蛋白质的分子量，是蛋白质的分子量，N为阿伏
13、加德罗常数，为阿伏加德罗常数，f为摩擦系数，为摩擦系数，R为气体常数，为气体常数，T为绝对温度，为绝对温度，D为扩散系数。为扩散系数。将上述两式代入将上述两式代入 得得沉降速度法NMmrpNDRTf fvmsp)1()1(vRTNDNMsr)1(vDsRTMr 此式称为此式称为Svedberg方程，代入各种数据可计算方程，代入各种数据可计算出蛋白质的分子量。蛋白质的出蛋白质的分子量。蛋白质的 约为约为0.74 cm3/gv氨基酸残基的偏微分比容氨基酸氨基酸偏微分比容偏微分比容(cm3/g)氨基酸氨基酸偏微分比容偏微分比容(cm3/g)Gly0.64Cys0.61Ala0.74Trp0.74Se
14、r0.63Tyr0.71Thr0.70His0.67Val0.86Arg0.70Leu、Ile0.90Lys0.82Pro0.76Asp0.60Met0.75Glu0.66Phe0.77Gln0.67沉降平衡法测蛋白质的分子量沉降平衡法 利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较低离利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较低离心转速下进行的（心转速下进行的（800020000r/min），离心开始），离心开始时，分子颗粒发生沉降，一段时间以后，沉降的结时，分子颗粒发生沉降，一段时间以后，沉降的结果造成了浓度梯度，因而产生了蛋白质分子反向扩果造成了浓度梯度，因而产生了蛋白质分子反向扩散运动，当反向扩散与离
15、心沉降达到平衡时，浓度散运动，当反向扩散与离心沉降达到平衡时，浓度梯度就固定不变了。梯度就固定不变了。沉降平衡法 在离心力作用下，蛋白质颗粒的沉降速度为在离心力作用下，蛋白质颗粒的沉降速度为dx/dt，在此沉降速度下，时间，在此沉降速度下，时间t内浓度为内浓度为c的溶液越的溶液越过横截面过横截面A的溶质量为的溶质量为 dtdtdxcAdm 因扩散作用沿相反方向越过横因扩散作用沿相反方向越过横截面截面A的溶质量为的溶质量为 dtdxdcDAmd沉降平衡法当达到平衡时当达到平衡时 ，0 mddmdtdxdcDAdtdtdxcAdxdcDdtdxc将将 和和 代入上式得代入上式得 xvfmdtdxp
16、2)1(NfRTD dxdcNfRTxvfmcp2)1(xdxcdcRTvNmp2)1(2221ln)1(dxcdRTvMr，22ln)1(2dxcdvRTMr沉降平衡法积分并代入积分限得积分并代入积分限得)()/ln()1(22122122xxccvRTMr 式中，式中，c1,c2是距离旋转轴心是距离旋转轴心x1,x2处的蛋白质处的蛋白质浓度，通过离心机上的光学系统可以测出这两个数浓度，通过离心机上的光学系统可以测出这两个数据。将各种数据代入上式可计算出蛋白质的分子量。据。将各种数据代入上式可计算出蛋白质的分子量。三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质颗粒是分蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质颗粒是分散相，水是散相，水是分散介质。根据分散相的分散程度可以分散介质。根据分散相的分散程度可以把分散系统分为把分散系统分为3类：分散相质点小于类：分散相质点小于1nm的为真的为真溶液；大于溶液；大于100nm的为悬浊液；介于的为悬浊液；介于1100nm之间之间的为胶体溶液的为胶体溶液。蛋白质的胶体性质 胶体溶液维持稳定要满足胶体溶液维持稳定要满足3个
