硫氧还蛋白过氧化物酶TPX活性测定试剂盒说明书.docx

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1、硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性测定试剂盒说明书微法100T/96S注意:正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。澜定意义:TPX属于过氧化物酶家族,在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用,功能与GPX类似,也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内,如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌,在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿痛发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。澜定原理:TPX催化H2O2氧化二硫苏糖醇(DTT),H2O2的吸收波长为240nm,通过测

2、定24Onm吸光度的下降速率,即可计算出TPX活性。自备仪器和用品:低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、和蒸储水试剂组成和配制:试剂一:液体12OmLXl瓶,室温保存。试剂二:液体20mLxl瓶,-20C保存。试剂三:液体2mLxl支,4七。粗液提取:1.组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:510的比例(建议称取约0.1g组织,加入ImL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4C离心IOmin,取上清置冰上待测。2.细菌、真菌:按照细胞数量(IO4个):试剂一体积(mL)为5001000:1的比例(建议500万细胞加入ImL试

3、剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3.血清等液体:直接测定。TPX涌定操作:取微量石英比色皿或96孔板,加入4L上清液,180L试剂二,16L试剂三,迅速混匀后于24Onm测定IOs和130s吸光度,记为Al和A2oTPX活性计算公式:a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算活性单位定义:25C或者37C中,每亳克蛋白每分钟催化InmOlH26降解为1个酶活单位。TPX(nmol/minmgprot)=(A1A2)dV反总(CPrXV样)T=573(A1-A2)Cpr(

4、2) .按样本质量计算活性单位定义:25C或者37中,每克样本每分钟催化InmOlH2。2降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/g鲜重)=(AI-A2)+dV反总+(WXV样V样总)T=573(A1-A2)W(3)按细胞数量计算活性单位定义:25C或者37中,每IO4个细胞每分钟催化InmolH2O2降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/l(Tcell)=(A1-A2)dV反总(细胞数量XV样V样总)T=573x(AlA2)细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义:25C或者37中,每亳升液体每分钟催化InmOlH26降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/m

5、L)=(Al-A2)+dV反总V样T=573(A1-A2):H2O2的摩尔消光系数,43600Lmolcm=0.0436Lmolcm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积(L),200L=210-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL);W:样品质量:V样:加入反应体系中上清液体积(mL),4L=410-3niL;V样总:提取液体积,1mL;T:反应时间(min),2minb.使用96孔板测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算活性单位定义:25C或者37中,每亳克蛋白每分钟催化InmOlH22降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/minmgprol)=(AI-A2)dV反

6、总(CPrXV样)T=1146(AI-A2)Cpr(2) .按样本质量计算活性单位定义:25C或者37中,每克样本每分钟催化InmOlH22降解为1个醉活单位。TPX活性(nmol/min/g鲜重)=(AI-A2)+dV反总(WxV样V样总)T=1146(A1-A2)W(3)按细胞数量计算活性单位定义:25C或者37C中,每10$个细胞每分钟催化InmolH2O2降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/KTcell)=(A1-A2)dV反总(细胞数量XV样V样总)T=1146x(AlA2)细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义:25C或者37中,每亳升液体每分钟催化InmOlH22降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/mL)=(Al-A2)dV反总V样T=1146(A1-A2)e:H2O2的摩尔消光系数,43600Lmolcm=0.0436Lmolcm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积(L),200L=210-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL);W:样品质量:V样:加入反应体系中上清液体积(mL),4LMxlO-3mL;V样总:提取液体枳,1mL;T:反应时间(min),2mi11o

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