磷酸化蛋白激酶C定量试剂盒说明书.docx

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1、磷酸化蛋白激酶C定量试剂盒说明书标本要求:1 .标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20C保存,但应避免反复冻融2 .不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。样本处理及要求:1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或49过夜后于IOoog离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融。2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2-80CIOoOg离心20分钟,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融。3. 组织匀浆:用预冷的PBS(0.01

2、M,pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如Ig的组织样品对应9矶的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。将匀浆液于500OXg离心510分钟,取上清检测。4. 细胞培养物上清或其它生物标本:100Og离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融.试剂盒性能:1 .灵敏度:ZUi小的检测浓度小于1号标准品。稀

3、释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990o2 .特异性:不与其它细胞因子反应。3 .重复性:板内、板间变异系数均小于10%。特点:1、高效、灵敏、特异的抗体;2、稳定的重复性和可靠性;3、吸附性能好,空白值低,孔底透明度高的固相载体;4、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型;5、节省实验经费。保存条件及有效期:1 .试剂盒保存:;2-8Co2 .有效期:6个月原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中血清素/血清胺(ST)水平。用纯化的血清素/血清胺(ST)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST),再与HRP标记

4、的血清素/血清胺(ST)抗体结合,形成抗体-抗原-酹标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血清素/血清胺(ST)呈正相关。用醯标仪在45Onnl波长下测定吸光度(0D值),通过标准曲线计算样品中血清素/血清胺(ST)浓度。操作步骤:1 .标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。80pgml5号标准品1501的原倍标准品加入1501标准品稀释液40pgml4号标准品150l的5号标准品加入150l标准品稀释液20pgml3号标准品1501的4号标准品加入1501

5、标准品稀释液IOpgZml2号标准品150l的3号标准品加入150l标准品稀释液5pgml1号标准品1501的2号标准品加入1501标准品稀释液1 .加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酹标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50l,待测样品孔中先加样品稀释液40l,然后再加待测样品10l(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。2 .温育:用封板膜封板后置37温育30分钟。3 .配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸储水30倍稀释后备用4 .洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重

6、复5次,拍干。5 .加酶:每孔加入酶标试剂50l,空白孔除外。6 .温育:操作同3。7 .洗涤:操作同5。8 .显色:每孔先加入显色剂A50l,再加入显色剂B50l,轻轻震荡混匀,37C避光显色10分钟.9 .终止:每孔加终止液50l,终止反应(此时蓝色立转黄色)。10 .测定:以空白孔调零,45Onm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。操作程序总结:惟各试剂,样品和标准品I入准备好的样品和标准品,37C反应30分钟I板5次,加入薛标试剂,37C反应30分铺杭板5次,加入显色液A、B,37C显色10分钟IJL加入年止制分钟之内读0l丁计算:以标准物的浓度为横

7、坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。注意事项:1 .试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酸标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。2 .浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。3 .各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。1 .请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(n5)o2 .封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。6 .底物请避光保存。7 .严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8 .所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9 .本试剂不同批号组分不得混用。

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