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1、第第9 9章章 酶促反应动力学酶促反应动力学研究酶促反应的速率以及影响速率的各种因素研究酶促反应的速率以及影响速率的各种因素底物浓度对酶反应速率的影响底物浓度对酶反应速率的影响 米氏方程米氏方程酶的抑制作用酶的抑制作用环境因素对酶反应的影响环境因素对酶反应的影响 1 底物浓度对酶反应速率的影响底物浓度对酶反应速率的影响1.1米氏学说的提出米氏学说的提出 酶有被底物所饱和的现象酶有被底物所饱和的现象双曲线双曲线 酶酶-底物复合物学说底物复合物学说(Enzyme-substrate complex)1903年，年，Herin-Wurtz 快速平衡学说快速平衡学说1913年年Michaelis和和M
2、enten 提出米氏方程提出米氏方程Ks为为ES的解离常数的解离常数Maud Menten1879-1960Leonor Michaelis1875-1949 稳态理论（稳态理论（Steady State）Briggs and Haldane in 1925Km=（k2+k3）/k1修正修正Michaelis-Menton EquationKm 米氏常数米氏常数 Vmax 最大反应最大反应速率速率3个假设个假设:（1）底物大过量，即底物大过量，即SE（2）P浓度极小，忽略浓度极小，忽略 这步反应这步反应ESE+Pk4（3）稳态假设：稳态假设：ES的生成速度和的生成速度和ES的分解速度的分解速度
3、相等，相等，ES 为常数，达到稳态。为常数，达到稳态。1.2 米氏方程式的推导米氏方程式的推导酶促反应分两步进行：酶促反应分两步进行：第一步：酶与底物作用，形成酶第一步：酶与底物作用，形成酶-底物复合物。底物复合物。第二步：第二步：ES复合物复合物分解分解形成产物形成产物，释放出游离酶。，释放出游离酶。酶与底物生成酶与底物生成ES的速度为：的速度为：注：ES分解的速度为：分解的速度为：当整个反应体系处于当整个反应体系处于稳态稳态时，时，ESES生成生成速度（速度（V V1 1）等于）等于ESES分解速度（分解速度（V V2 2）：）：令:将（将（2）代入（）代入（1）用用Et代表酶的总浓度，则
4、代表酶的总浓度，则得：得：将（将（4 4）代入（）代入（3 3）酶促反应速度酶促反应速度v取决于取决于ES转换为转换为E+P的速度的速度得：得：当反应体系中的底物浓度极大，而使所有的酶分子都当反应体系中的底物浓度极大，而使所有的酶分子都以以ES形式存在时，反应速度达到最大值（即最大反应形式存在时，反应速度达到最大值（即最大反应速度，速度，V）。）。得：得：将（将（6）代入（）代入（5）米氏方程式米氏方程式Km-米氏常数米氏常数（Michaelis-Menton constant）表明当已知表明当已知Km和和Vmax时，酶反应速率与底物浓时，酶反应速率与底物浓度的定量关系。度的定量关系。Km的物
5、理意义的物理意义Km值是当酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度值是当酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。单位是底物浓度的单位，一般用单位是底物浓度的单位，一般用mol/L或或mmolL表表示。示。计算：底物浓度计算：底物浓度反应速度反应速度底物浓度较低时，底物浓度较低时，S Km，米氏方程式的分母中，米氏方程式的分母中S一项一项可以忽略不计，得：可以忽略不计，得：反应速度与底物浓度成正比，反应速度与底物浓度成正比，符合一级反应。符合一级反应。在底物浓度很高时，在底物浓度很高时，SKm，米氏方程中，米氏方程中，Km可以忽略不可以忽略不计，得计，得 反应速度与底物浓度无关，反应速度与底物
6、浓度无关，符合零级反应符合零级反应测定酶活力测定酶活力1.3米氏常数的意义米氏常数的意义 Km是酶的一个特征常数。是酶的一个特征常数。Km的大小的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。鉴别酶：鉴别酶：25，最适，最适pH的的Km值值 Km可以判断酶的专一性和天然底物。可以判断酶的专一性和天然底物。酶的最适底物或天然底物：酶的最适底物或天然底物：Km值最小的底物值最小的底物酶对底物亲和力的大小：酶对底物亲和力的大小：1/Km 最适底物的亲和力（最适底物的亲和力（1/Km）最大，）最大，Km最小最小,达最大反达最大反应速率一半时所需要的底物浓度愈小。应速率一半时所
7、需要的底物浓度愈小。1.4 米氏常数的求法米氏常数的求法双倒数作图法双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法作图法）以以1 1SS为横坐标，为横坐标，以以1 1v v为纵坐标作图为纵坐标作图 缺点：缺点：实验点过于集中于直线的左端，实验点过于集中于直线的左端，作图不易十分准确。作图不易十分准确。2 酶的抑制作用酶的抑制作用2.1 抑制作用抑制作用失活作用失活作用（inactivation）：酶蛋白）：酶蛋白变性变性而引起而引起活力丧失。活力丧失。变性剂对酶变性剂对酶无选择性无选择性。抑制作用抑制作用（inhibition）：酶的酶的必须基团必须基团化学性化学性质的改变，引起酶活力降低
8、或丧失。但酶质的改变，引起酶活力降低或丧失。但酶未变性。未变性。一种抑制剂一种抑制剂只能只能使一种酶或一类酶产生抑制作用。使一种酶或一类酶产生抑制作用。不可逆的抑制作用（不可逆的抑制作用（irreversible inhibition）：）：抑制剂与酶的必须基团以抑制剂与酶的必须基团以共价键共价键结合而引起酶活力结合而引起酶活力丧失，丧失，不能不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。而使酶复活。可逆的抑制作用（可逆的抑制作用（reversible inhibition）：抑制剂与酶的必须基团以抑制剂与酶的必须基团以非共价键非共价键结合而引起酶活结合而引起
9、酶活力丧失，力丧失，能能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。而使酶复活。可逆的抑制作用：可逆的抑制作用：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。2.2 分类分类根据抑制剂与酶作用方式及是否可逆根据抑制剂与酶作用方式及是否可逆2.3 2.3 竞争竞争性抑制作用性抑制作用（competitive inhibition)概念概念：抑制剂与底物抑制剂与底物竞争竞争酶的结合部位酶的结合部位，从而，从而影响影响了了底物与酶的底物与酶的正常正常结合。结合。最常见的一种可逆抑制作用。最常见的一种可逆抑制作用。原因原因：抑制剂与底物
10、的抑制剂与底物的结构类似结构类似，与酶可，与酶可形成可逆的复合物形成可逆的复合物，但但此复合物不可能分解成产物此复合物不可能分解成产物，酶反应速酶反应速率率下降。下降。增加底物浓度可解除这种抑制。增加底物浓度可解除这种抑制。动画 竞争性抑制的特征竞争性抑制的特征 a 反应式：反应式：EI+SESIb动力学方面动力学方面:VmaxVmax不不变，但变，但KmKm增大增大。竞争性抑制的临床应用意义竞争性抑制的临床应用意义 磺胺类药物磺胺类药物：对氨基苯磺酰胺：对氨基苯磺酰胺磺胺类药物有抑制细菌生长繁殖的作用，而不伤害人和畜禽。磺胺类药物有抑制细菌生长繁殖的作用，而不伤害人和畜禽。叶酸和二氢叶酸是四
11、氢叶酸的前体。（二氢叶酸合成酶）叶酸和二氢叶酸是四氢叶酸的前体。（二氢叶酸合成酶）PABA人：人：叶酸叶酸（食物）（食物）FH2FH4叶酸还原酶叶酸还原酶FH2还原还原酶酶细菌：细菌：PABAFH2合成酶合成酶FH2FH4FH2还原还原酶酶对氨基苯磺胺对氨基苯磺胺与与PABA两者竞争两者竞争FH2合成酶合成酶细菌：细菌：PABAFH2合成酶合成酶FH2FH4抗菌增效剂抗菌增效剂TMP与与FH2相似，抑制细菌相似，抑制细菌FH2还原酶还原酶细菌：细菌：PABAFH2合成酶合成酶FH2FH4FH2还原还原酶酶2.4 非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibitio
12、n）概念概念：底物和抑制剂同时与酶结合，两者没有竞争作用。底物和抑制剂同时与酶结合，两者没有竞争作用。抑制剂（抑制剂（I I）和底物（）和底物（S S）可以同时结合在酶分子（）可以同时结合在酶分子（E E）的不同）的不同部位上，形成部位上，形成ESIESI三元复合物。但是，中间产物三元复合物。但是，中间产物ESIESI三元复三元复合物不能进一步分解为产物合物不能进一步分解为产物,酶酶活力降低。活力降低。动画原因原因抑制剂的抑制剂的结构结构可与底物毫无相关之处可与底物毫无相关之处 如亮氨酸是精氨酸的一种非竞争性抑制剂如亮氨酸是精氨酸的一种非竞争性抑制剂 加入加入大量底物不能解除大量底物不能解除非
13、竞争性抑制剂对酶活性的抑非竞争性抑制剂对酶活性的抑制。这是不同于竞争性抑制的一个特征制。这是不同于竞争性抑制的一个特征。特征特征a反应式反应式 b b动力学方面动力学方面：VmaxVmax降低，但降低，但KmKm值不改变。值不改变。2.5 反竞争性抑制反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）概念概念酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合。与酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合。与抑制剂结合后的三元复合物不能形成产物。抑制剂结合后的三元复合物不能形成产物。特征特征a反应式反应式：b动力学方面动力学方面：VmaxVmax和和KmKm值值均均降低。降低。P373E+IEI 有机
14、磷化合物有机磷化合物 POOXOR1R2POOXR2R1或或 化学结构通式化学结构通式:R1、R2:烷基烷基;X:-F等等2.6 不可逆抑制不可逆抑制（irreversible inhibition）有机磷化合物有机磷化合物:与酶活直接相关的丝氨酸上的羟基牢固结合，与酶活直接相关的丝氨酸上的羟基牢固结合，从而抑制某些蛋白酶及酯酶。从而抑制某些蛋白酶及酯酶。神经毒气神经毒气DFP、有机磷杀虫剂、有机磷杀虫剂E-S H +COOHHgCl有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷化合物 与酶中的半胱氨酸残基的巯基作用，抑制含巯基的酶与酶中的半胱氨酸残基的巯基作用，抑制含巯基的酶COOHHgSE+HCl重金
15、属盐重金属盐如含如含Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等金属盐能使大多数酶失活等金属盐能使大多数酶失活烷化试剂烷化试剂例例 ICH2COOH，ICH2CONH2等等 E-S H +I CH2COOHE-S-CH2COOH +HI 青霉素青霉素糖肽转肽酶糖肽转肽酶：在细菌细：在细菌细胞壁合成中使肽聚糖胞壁合成中使肽聚糖链交联。链交联。与活性部位丝氨酸羟基与活性部位丝氨酸羟基共价结合，使酶失活，共价结合，使酶失活，影响肽聚糖链交联，影响肽聚糖链交联，导致细菌细胞壁合成导致细菌细胞壁合成受阻，细菌生长被损受阻，细菌生长被损害。害。温度温度pH值值激活剂激活剂抑制剂抑制剂3 环境因素对酶反应的影响环
16、境因素对酶反应的影响 温度对酶反应的影响温度对酶反应的影响最适温度最适温度（optimum temperature）：）：受底物的种类、浓度受底物的种类、浓度,溶液的离子强度溶液的离子强度,pH,pH,反应时间等的影响。反应时间等的影响。pHpH对酶反应的影响对酶反应的影响反反应应速速度度pH最最 适适 p pH H68100反应速度反应速度pH最适最适pH（optimum pH）:受到底物的种类、浓度、受到底物的种类、浓度、缓冲液缓冲液的种类等影响。的种类等影响。胃蛋白酶过氧化氢酶精氨酸酶phosphatase碱性磷酸酶胃黏膜 激活剂对酶反应的影响激活剂对酶反应的影响激活剂激活剂（activator)：凡是能提高酶活性的物质。凡是能提高酶活性的物质。金属离子：如金属离子：如Na+、K+、Mg2+、Ca2+Zn2+、Fe2+等。等。无机离子无机离子阴离子：如阴离子：如Cl-、Br-等等氢离子氢离子选择性选择性 有的金属离子可以互相替代有的金属离子可以互相替代 有的离子间有拮抗作用有的离子间有拮抗作用浓度要适中浓度要适中 有机分子有机分子某些还原剂如某些还原剂如Cys、GSH等等EDTA
