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1、第五章植物细胞培养和次生第五章植物细胞培养和次生代谢产物生产代谢产物生产第五章第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产 主要内容：主要内容：第一节第一节 植物单细胞培养技术植物单细胞培养技术 第二节第二节 植物细胞的大规模培养植物细胞的大规模培养 第三节第三节 植物细胞生物反应器植物细胞生物反应器 第四节第四节 植物细胞培养生产次生代谢产物植物细胞培养生产次生代谢产物 学习的目标与要求：学习的目标与要求：掌握单细胞分离和培养的方法，了解植物大规模培养掌握单细胞分离和培养的方法，了解植物大规模培养方法，了解植物细胞生物反应器的设计与要求。了解利用方法，了解植物细胞生物
2、反应器的设计与要求。了解利用植物细胞培养生产次生代谢产物的流程。植物细胞培养生产次生代谢产物的流程。植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产 植物是人类赖以生存的食物和药品的重要来源之一。植物是人类赖以生存的食物和药品的重要来源之一。80%的天然产物来自于高等植物的天然产物来自于高等植物。资源的过度采掘资源的过度采掘，造成了许多植物资源的日益枯竭。，造成了许多植物资源的日益枯竭。通过通过植物细胞培养植物细胞培养是弥补这方面的重要研究方向是弥补这方面的重要研究方向植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产红豆杉惨遭剥皮红豆杉惨遭剥皮植物细胞培养和次生代谢产物
3、生产植物细胞培养和次生代谢产物生产细细胞胞产产物物的的工工厂厂化化生生产产植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产 什么是植物细胞培养什么是植物细胞培养?与组织培养的区别与组织培养的区别?植物细胞培养植物细胞培养(plant cell culture):是指在离体条件下是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。大量细胞群体的一种技术。1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议：年国际组织培养协会专业术语委员会建议：组织培养组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生：从机体
4、内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。细胞培养细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。此时细胞不再形成组织。植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产植物组织培养植物组织培养培养对象培养对象 植物的各种组织、器官植物的各种组织、器官培养目的培养目的 获得所需的植物组织和再获得所需的植物组织和再生植株；快速繁殖。生植株；快速繁殖。细胞培养细胞培养培养对象培养对象各种形式的植物细胞各种形式的植物细胞培养目的培养目的获得所需的细胞和各
5、种所获得所需的细胞和各种所需的产物；进行生物转化；需的产物；进行生物转化；将外源底物转化为所需的将外源底物转化为所需的产物。产物。与植物组织培养的区别与植物组织培养的区别 植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养的应用植物细胞培养的应用 获得的细胞群体可以作为获得的细胞群体可以作为制备有制备有价值代谢产物的原料价值代谢产物的原料，也可以作，也可以作为基础研究的材料。为基础研究的材料。同时植物细胞培养技术也是同时植物细胞培养技术也是人工人工种子种子、原生质体培养原生质体培养、花药培养花药培养等的支撑技术等的支撑技术植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代
6、谢产物生产与微生物相比，植物细胞的与微生物相比，植物细胞的特点：特点：u细菌、真菌、植物细胞都细菌、真菌、植物细胞都有细胞壁有细胞壁u细菌无成形的细胞核，真细菌无成形的细胞核，真菌、植物细胞有成形的细胞菌、植物细胞有成形的细胞核。核。u细菌只有核糖体一种细胞细菌只有核糖体一种细胞器。器。u植物细胞比微生物细胞大植物细胞比微生物细胞大植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞的特点：植物细胞的特点：植物细胞直径一般约会植物细胞直径一般约会10-200微米，平均直径比微生物细胞大微米，平均直径比微生物细胞大30-100倍。倍。植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定
7、细胞数的非均相植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。细胞团方式存在。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要般需要2-3周，半连续或连续培养时间一般长达周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月个月 植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难困难 植物细胞培养一般需要光照，通过光合
8、作用合成有机物，因此氧气和植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。的含量与传递对细胞培养影响较大。植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养和次生代谢产物生产植物细胞培养的方法植物细胞培养的方法 按培养规模：小规模培养和大规模培养按培养规模：小规模培养和大规模培养 按培养方式：平板培养法、悬浮培养、看护培养、按培养方式：平板培养法、悬浮培养、看护培养、微微室培养等；室培养等；按培养基类型：固体培养和液体培养按培养基类型：固体培养和液体培养 按要求产物按要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养
9、。细胞培养。一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术 固体培养：固体培养：是在微生物培养基基础上发展起来的植物细胞是在微生物培养基基础上发展起来的植物细胞培养方法。一般添加一定比例的琼脂起固化作用。培养方法。一般添加一定比例的琼脂起固化作用。固定化培养：固定化培养：属于固体培养，指将游离细胞包埋在多糖或属于固体培养，指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物制备的网状支持物中，培养液呈流动状态的无多聚化合物制备的网状支持物中，培养液呈流动状态的无菌操作技术。菌操作技术。液体培养：液体培养：也是在微生物培养基础上发展起来的。也是在微生物培养基础上发展起来的。可分为可分为:振荡培养、旋转培养、静止培养
10、、纸桥培养振荡培养、旋转培养、静止培养、纸桥培养 细胞悬浮培养：细胞悬浮培养：属于液体培养，指植物细胞或小细胞团在属于液体培养，指植物细胞或小细胞团在液体培养基中大规模进行培养。液体培养基中大规模进行培养。一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术振荡培养箱振荡培养箱一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术1.单细胞的分离单细胞的分离 1)机械法机械法：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。离的单细胞。优点：细胞不受酶伤害。优点：细胞不受酶伤害。缺点：只适合于排列松散的薄壁细胞、效率低、产量缺点：只适合于排列松散的薄壁细胞、效率低、产量少。
11、少。1969年，年，Gnanam和和Kulandaivelu用该方法分离出用该方法分离出几种成熟叶片叶肉细胞。几种成熟叶片叶肉细胞。一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术 1.单细胞的分离单细胞的分离机械法机械法撕去下表皮撕去下表皮露出叶肉细胞露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞用解剖刀刮下细胞第一种方法：用刀片刮叶片第一种方法：用刀片刮叶片一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术 1.单细胞的分离单细胞的分离机械法机械法研碎成粉研碎成粉加研磨介质加研磨介质过滤、离心过滤、离心第二种方法：叶片研碎、离心第二种方法：叶片研碎、离心一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术 1.单细胞的分离单
12、细胞的分离 2）酶解法）酶解法：指用专一的水解酶：指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等）琼脂酶等）在温和条件下分解胞间层，分离细胞。在温和条件下分解胞间层，分离细胞。优点：最有效的一种方法。优点：最有效的一种方法。缺点：成本较高，酶对细胞有一定伤害。缺点：成本较高，酶对细胞有一定伤害。1968年，年，Takebe等用该方法分离烟草叶肉细胞成功。等用该方法分离烟草叶肉细胞成功。一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术 1.单细胞的分离单细胞的分离加果胶酶加果胶酶过滤、离心过滤、离心一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术机械法和酶解法比较机械法和酶解法比较机械法
13、机械法酶解法酶解法1.细胞不受到酶的伤害；细胞不受到酶的伤害；2.不用质壁分离；不用质壁分离；3.细胞产量低；细胞产量低；4.细胞易破。细胞易破。1.细胞受到酶的伤害；细胞受到酶的伤害；2.要质壁分离；要质壁分离；3.细胞产量高；细胞产量高；4.细胞不易破。细胞不易破。1.单细胞的分离单细胞的分离一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术1.单细胞的分离单细胞的分离3）由培养组织分离单细胞：）由培养组织分离单细胞：指将愈伤组织反复继代，再转移指将愈伤组织反复继代，再转移至液体培养基振荡培养。添加生长素或酶有利。至液体培养基振荡培养。添加生长素或酶有利。这是分离单细胞通常采取的方法。这是分离单
14、细胞通常采取的方法。诱导产生愈伤组织；诱导产生愈伤组织；愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；织的松散性；将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物外植体外植体连续继代培养愈伤组织连续继代培养愈伤组织 筛选未分化和易散碎的愈伤组织筛选未分化和易散碎的愈伤组织 振荡培养振荡培养 过滤和离心过滤和离心理想的细胞悬浮液理想的细胞悬浮液建立单细胞悬浮液的程序建立单细胞悬浮液的程序诱导和筛选愈伤组织诱导和筛选愈伤组织促使细胞游离，获得单细胞促使细胞游离，获得单细胞一、植物单细胞培养技术一、植物单细
15、胞培养技术1.单细胞的分离单细胞的分离愈伤组织诱导法愈伤组织诱导法一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术建立悬浮细胞培养系建立悬浮细胞培养系一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术 2.单细胞培养技术单细胞培养技术1）平板培养法）平板培养法指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。进行培养的方法。此法是此法是Bergman(贝格曼，贝格曼，1960)首创。平板培养的首创。平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察,选择单细胞株选择单细胞株和筛选突变体。和筛选突变体。一、植物单
16、细胞培养技术一、植物单细胞培养技术 2.单细胞培养技术单细胞培养技术 1）平板培养法）平板培养法 a.步骤步骤 制备单细胞悬浮液制备单细胞悬浮液 调制悬浮培养液中的细胞密度调制悬浮培养液中的细胞密度 倾倒平板倾倒平板(植板植板)密封、标记和培养密封、标记和培养 b.优劣优劣 平板培养法的优点在于单细胞在培养基中分布较为均平板培养法的优点在于单细胞在培养基中分布较为均匀，也便于定点观察，缺点是容易造成培养细胞的通气不匀，也便于定点观察，缺点是容易造成培养细胞的通气不良。良。一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术平板培养法平板培养法2.单细胞培养技术单细胞培养技术1）平板培养法）平板培养法一、植物单细胞培养技术一、植物单细胞培养技术2.单细胞培养技术单细胞培养技术1）平板培养法）平板培养法 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数每个平板形成的细胞团数植板率植板率 每个平板接种的细胞总数每个平板接种的细胞总数一、植物单细
