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1、第四章第四章 植物细胞培养植物细胞培养 植物细胞培养（植物细胞培养（plant cell cultureplant cell culture）是指）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。培养使其增殖的技术。根据培养规模：小规模培养和大批量培养；根据培养规模：小规模培养和大批量培养；根据培养方式：悬浮培养、单细胞培养等；根据培养方式：悬浮培养、单细胞培养等；根据要求产物：用于诱变的细胞培养和生产根据要求产物：用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。次生产物的细胞培养。第五章第五章 植物细胞培养植物细胞培养4.1 单细胞分离
2、单细胞分离4.3 单细胞培养技术单细胞培养技术4.2 悬浮培养悬浮培养4.4 细胞培养与次生产物生产细胞培养与次生产物生产由完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞由培养组织中分离单细胞4.1 单细胞分离单细胞分离叶片是分离单细胞的最好材料叶片是分离单细胞的最好材料 (1)(1)机械法机械法 (2)(2)酶解法酶解法4.1.1 由完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞撕去下表皮撕去下表皮露出叶肉细胞露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞用解剖刀刮下细胞(1)机械法机械法用刀片刮叶片用刀片刮叶片叶片研碎、离心叶片研碎、离心研碎匀浆研碎匀浆加研磨介质加研磨介质过滤
3、、离心过滤、离心(1)(1)机械法机械法只有薄壁组织排列松只有薄壁组织排列松散，细胞间接触点很散，细胞间接触点很少时用机械法分离叶少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。肉细胞才能取得成功。Takebe Takebe等（等（19681968）最早报道：用果胶酶处理）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞可以分离大量的叶肉细胞(2)(2)酶解法酶解法加果胶酶加果胶酶过滤、离心过滤、离心(1)(1)诱导产生愈伤组织；诱导产生愈伤组织；(2)(2)愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；愈伤组织的松散性；4.1.2 由培养组织分离单细胞由培养
4、组织分离单细胞步骤：步骤：茎段茎段摇床用于振荡摇床用于振荡继代继代悬浮悬浮15ml medium/1g120rpm culturetransfer 1time/3d 3 weeks100-130目网过滤目网过滤Centrifuge(离心）离心）isolation(3)(3)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物 选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。常使用的外植体。选择适宜的培养基：较高激素浓度，特别是选择适宜的培养基：较高激素浓度，特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、生长素，必要
5、的附加物质，例如水解酪蛋白、ProPro、GlnGln。继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。注意注意 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。在液体培养基中进行培养增殖的技术。4.2 细胞悬浮培养细胞悬浮培养4.2.1 细胞悬浮培养的概念和意义细胞悬浮培养的概念和意义Bioreactor for continuous cell suspensions Shaker for suspension culture Culture wheel (1)(1)细胞可以不断增殖，形成高密度的细
6、胞细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；群体，适于大规模培养；(2)(2)能够提供大量较为均匀的细胞，为研究能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。细胞的生长、分化创造方法和条件。4.2.1 细胞悬浮培养的概念和意义细胞悬浮培养的概念和意义Cell suspensionPlantsArtificial seedsSecondary productsIsolation protoplastsMutation select4.2.2 细胞悬浮培养的应用细胞悬浮培养的应用(1)(1)培养基培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养对于用愈伤组织制备的悬
7、浮细胞培养的培养基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需要进行一些调节。素的比例需要进行一些调节。4.2.3 细胞悬浮培养的方法细胞悬浮培养的方法最低有效密度的概念最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。始密度。最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养
8、基的成分不同而有差异，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，一般为一般为10104 4-10-105 5细胞细胞/ml/ml。4.2.3 细胞悬浮培养的方法细胞悬浮培养的方法(2)(2)培养细胞的起始密度及细胞记数培养细胞的起始密度及细胞记数细胞记数细胞记数 要保证细胞培养的最低有效密度，在细要保证细胞培养的最低有效密度，在细胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可用胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可用血球记数板。血球记数板。(2)(2)培养细胞的起始密度及细胞记数培养细胞的起始密度及细胞记数活细胞测定活细胞测定 除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率以作
9、为测定起始密度的参考。以作为测定起始密度的参考。活细胞率（活细胞率（%）=（5 5个视野中的活细胞数个视野中的活细胞数/5/5个视野中的细胞总数）个视野中的细胞总数）*100%100%(2)(2)培养细胞的起始密度及细胞记数培养细胞的起始密度及细胞记数A A、醋酸酯荧光素（、醋酸酯荧光素（FDAFDA）染色法）染色法 FDAFDA本身无荧光，无极性，可自由通过原生质本身无荧光，无极性，可自由通过原生质体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自由分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自由出入原生质体膜，在荧
10、光显微镜下观察到荧光的是出入原生质体膜，在荧光显微镜下观察到荧光的是有活力的，反之无活力。具体操作：有活力的，反之无活力。具体操作：取取0.5ml0.5ml细胞悬浮液放入到小试管中，加入细胞悬浮液放入到小试管中，加入FDAFDA溶液，使最后浓度达到溶液，使最后浓度达到0.01%0.01%，混匀，室温下作用，混匀，室温下作用5min5min，荧光显微镜观察。，荧光显微镜观察。活细胞测定的方法活细胞测定的方法B B、酚藏红花染色法、酚藏红花染色法 先配制先配制0.1%0.1%酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴查时将悬浮细胞取一滴放在
11、载玻片上，滴一滴0.1%0.1%酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无色的是活细胞。色的是活细胞。（3 3）悬浮培养细胞数目的增殖变化）悬浮培养细胞数目的增殖变化细胞生长各个时期的特点细胞生长各个时期的特点滞后期（延迟期）滞后期（延迟期）细胞很少分裂，其长短与接种细胞很少分裂，其长短与接种 量大小和继代时原种细胞所处的生量大小和继代时原种细胞所处的生 长期有关。长期有关。对数生长期对数生长期 细胞分裂活跃，细胞数目增加，增细胞分裂活跃，细胞数目增加，增 长速率保持不变。长速率保持不变。直线生长期直线生长期 细胞增值、生长和发育最明显的时期。细胞
12、增值、生长和发育最明显的时期。缓缓 慢慢 期期 生长逐渐缓慢生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有培养液消耗将尽，有 毒代谢物质增多，氧气减少。毒代谢物质增多，氧气减少。静静 止止 期期 生长几乎处于停止状态，细胞数目生长几乎处于停止状态，细胞数目 增加极少，甚至开始死亡。增加极少，甚至开始死亡。A A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。的生长期和转入细胞数量的多少。B B、加入条件培养基可以缩短滞后期。、加入条件培养基可以缩短滞后期。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。条件培养基：曾培养过一段时间
13、组织或细胞的培养基。C C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。保持对数生长期。D D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。引起细胞的大量死亡和解体。讨论讨论 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（只能通过单细胞或小细胞团（2-42-4细胞），使用细胞），使用吸管或注射器。吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上
14、层悬浮液。降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。操作注意事项操作注意事项 对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提供依据。供依据。A A、细胞记数：、细胞记数：注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因此此 通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可用用5%-8%5%-8%铬酸或铬酸或
15、0.25%0.25%的果胶酶对细胞团进行处理。生长速的果胶酶对细胞团进行处理。生长速率率p p P=P=（lnX-lnXlnX-lnX0 0）/t/t X X为为t t时间的细胞密度，时间的细胞密度，X0X0为起始细胞密度为起始细胞密度（4 4）细胞生长的测定）细胞生长的测定B B、细胞大小的测定：显微测微计技术；、细胞大小的测定：显微测微计技术；C C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml15ml刻刻度离心管中于度离心管中于2000g2000g离心离心5min5min。以每毫升培养液中细胞。以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示。体积的毫升数
16、来表示。D D、细胞的干重和鲜重的测定：将一定量的细胞悬浮液、细胞的干重和鲜重的测定：将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在片上，然后在6060烘烘12h12h，在干燥器中冷却后称重。细，在干燥器中冷却后称重。细胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。E E、有丝分裂指数、有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，分裂进行的速度越快。分裂进行的速度越快。一般用孚尔根染色法，先将组织用一般用孚尔根染色法，先将组织用1molHCl1molHCl在在6060水解后染色，常规镜检，统计水解后染色，常规镜检，统计500500个细胞，个细胞，计
