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1、基于单克隆抗体的多元弧菌免疫学检测技术的研究基于单克隆抗体的多元弧菌免疫学检测技术的研究 2Contents 抗抗OmpW多克隆抗体的制备与特性分析多克隆抗体的制备与特性分析 4 研究背景及立论依据研究背景及立论依据1 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析 2 副溶血弧菌副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达基因的克隆与表达 3 抗抗OmpW单克隆抗体的制备与特性分析单克隆抗体的制备与特性分析5 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立多元弧菌流式细胞术检测方法的建立6 结论结论73第一章第一章 研究背景及立论依据研究背景及立论依据1、形态：弧状或短杆状，有鞭毛、形态：
2、弧状或短杆状，有鞭毛2、染色性：革兰氏阴性菌、染色性：革兰氏阴性菌3、培养特性：营养要求不高，嗜盐，在、培养特性：营养要求不高，嗜盐，在含有含有3.5%的的NaCl培养基中生长良好，培养基中生长良好，pH 7.0-9.5，TCBS培养基上易生长。培养基上易生长。4、生化反应：氧化酶阳性，发酵葡萄糖、生化反应：氧化酶阳性，发酵葡萄糖、麦芽糖，不发酵乳糖、蔗糖；吲哚、赖麦芽糖，不发酵乳糖、蔗糖；吲哚、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和硝酸盐还氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验均阳性。原试验均阳性。1.1 1.1 弧菌生物学性状弧菌生物学性状4第一章第一章 研究背景及立论依据研究背景及立论依据1.2
3、 1.2 研究背景研究背景及立论依据及立论依据弧菌弧菌哈维氏弧菌哈维氏弧菌人畜共患病原菌人畜共患病原菌引起鱼体表出血性溃疡，食欲引起鱼体表出血性溃疡，食欲不振，严重时鳞片脱落，烂鳍，不振，严重时鳞片脱落，烂鳍，眼内出血或变浑浊，肝肾等内眼内出血或变浑浊，肝肾等内脏出血，肠道发炎充血。也可脏出血，肠道发炎充血。也可感染虾和贝类。感染虾和贝类。鳗弧菌鳗弧菌溶藻弧菌溶藻弧菌创伤弧菌创伤弧菌副溶血弧菌副溶血弧菌引起人类胃肠炎、伤引起人类胃肠炎、伤口感染和原发性败血口感染和原发性败血症。症。鉴于国内外对多种病原弧菌的重视，探讨建立快速同时检测多种病原弧鉴于国内外对多种病原弧菌的重视，探讨建立快速同时检测
4、多种病原弧菌的方法菌的方法,在海水水产养殖病害的调查和防治、水产品卫生质量检验和保护在海水水产养殖病害的调查和防治、水产品卫生质量检验和保护公众健康等方面都具有十分重要的意义。公众健康等方面都具有十分重要的意义。5第一章第一章 研究背景及立论依据研究背景及立论依据筛选、克隆、表达和纯筛选、克隆、表达和纯化制备多元弧菌高同源化制备多元弧菌高同源性外膜蛋白性外膜蛋白制备抗制备抗r-Omp多克隆抗多克隆抗体，并进行特性分析体，并进行特性分析取其脾细胞与骨髓瘤取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细细胞，进行细胞融合胞，进行细胞融合筛选分泌抗多元弧菌单克隆抗体筛选分泌抗多元弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的杂交瘤细
5、胞株，体内法体内法生产单抗生产单抗 建立基于单抗的多元建立基于单抗的多元 弧菌免疫学检测方法弧菌免疫学检测方法免疫免疫BALB/c小鼠小鼠1.3 1.3 技术路线技术路线6第二章第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析 外膜是革兰氏阴性菌细胞壁特有的结构，它位于细胞壁的最外层，厚外膜是革兰氏阴性菌细胞壁特有的结构，它位于细胞壁的最外层，厚810 nm，约占细胞壁干重的约占细胞壁干重的80%，通常由磷脂、若干种外膜蛋白，通常由磷脂、若干种外膜蛋白(Omp)和脂多糖和脂多糖(LPS)组成。组成。2.1 2.1 革兰氏阴性菌外膜的结构革兰氏阴性菌外膜的结构 7
6、第二章第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析2.2 2.2 多元弧菌多元弧菌OmpK蛋白质序列比对蛋白质序列比对 对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、3株哈维氏弧菌（Vh）和3株创伤弧菌（Vv）的OmpK蛋白质序列进行多重序列比对分析，在不同弧菌种内不同弧菌种内OmpK蛋白质序列的平均一致性（Identity）分别为：溶藻弧菌85%，副溶血弧菌78%，哈维氏弧菌78%，创伤弧菌85.3%。不同弧菌种间：不同弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpK蛋白质序列的平均一致性分别
7、为76.5%、81.6%、79.8%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpK蛋白质序列的平均一致性78.1%、72.5%；哈维氏弧菌与创伤弧菌OmpK蛋白质序列的平均一致性79.9%。图图2-1 四种弧菌四种弧菌OmpK蛋白质序列比对图蛋白质序列比对图 82.3 2.3 多元弧菌多元弧菌OmpU蛋白质序列比对蛋白质序列比对 第二章第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析 通过对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、2株哈维氏弧菌（Vh）和3株创伤弧菌（Vv）的OmpU蛋白质序列比对分析发现，在不
8、同弧菌种内不同弧菌种内OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为：溶藻弧菌70.3%，副溶血弧菌96.5%，哈维氏弧菌85%，创伤弧菌89.3%。不同弧菌种间：不同弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为75.7%、71.7%、67%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌、创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性分别为82%、75.4%；哈维氏弧菌与创伤弧菌OmpU蛋白质序列的平均一致性为70.8%。图图2-2 四种弧菌四种弧菌OmpU蛋白质序列比对图蛋白质序列比对图 92.4 2.4 多元弧菌多元弧菌OmpW蛋白质序列比对蛋白质序列比对 第二章第二章 多元弧菌三种外
9、膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析 对NCBI Protein Database中抽取的3株溶藻弧菌（Va）、3株副溶血弧菌（Vp）、3株哈维氏弧菌（Vh）的OmpW蛋白质序列比对分析发现，不同弧菌种内不同弧菌种内OmpW蛋白质序列的平均一致性分别为：溶藻弧菌96.0%，副溶血弧菌100%，哈维氏弧菌95.3%。不同种弧菌种间不同种弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为93%、90.1%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列平均一致性为89%。图图2-3 三种弧菌三种弧菌OmpW蛋白质序列比对图蛋白质序列比对图 10OmpKOmp
10、UOmpW种类溶藻弧菌副溶血弧菌哈维氏弧菌溶藻弧菌副溶血弧菌哈维氏弧菌溶藻弧菌副溶血弧菌哈维氏弧菌溶藻弧菌8576.581.670.375.771.7969390.1副溶血弧菌7878.196.58210089哈维氏弧菌788595.32.5 2.5 三种蛋白在多元弧菌种内、种间的平均一致性比较（%）第二章第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析 综合比较多种弧菌种内、种间的三种外膜蛋白OmpK、OmpU和OmpW的序列一致性，OmpW蛋白质在溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌种内的序列一致性高于其他两种外膜蛋白；而在不同弧菌种间，溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈
11、维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为93%、90.1%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列平均一致性为89%，均高于OmpK和OmpU在该三种弧菌种间的一致性。以上分析结果表明，OmpW是溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌三种弧菌的高度保守外膜蛋白，是作为三种弧菌的共同菌体表面抗原共同菌体表面抗原的较优选择。11菌株与Vp RIMD 2210633OmpW蛋白质序列的一致性英文名称中文名称1Escherichia coli IAI39大肠杆菌57%2Shigella dysenteriae Sd197痢疾志贺菌57%3Citrobacter koseri ATCC BAA-895柯氏柠
12、檬酸杆菌56%4Shewanella putrefaciens 200腐败希瓦氏菌56%5Shewanella halifaxensis HAW-EB4希瓦氏菌(halifaxensis)56%7Citrobacter youngae ATCC 29220杨氏柠檬酸杆菌55%8Shigella sonnei Ss046索氏志贺菌55%9Citrobacter rodentium ICC168柠檬酸杆菌(rodentium)53%10Klebsiella pneumoniae 342肺炎克雷伯菌53%2.6 2.6 与Vp RIMD 2210633的OmpW蛋白质序列的一致性较高的非弧菌 第二章
13、第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析 在NCBI网站中，使用protein blast程序，在NCBI nr Database中搜索与副溶血弧菌标准株Vibrio parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列的一致性较高的非弧菌菌株。12第二章第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析图2-4 副溶血弧菌与大肠杆菌的OmpW蛋白质序列比对图Query:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct:E.coli IAI39的OmpW蛋白
14、质序列 图2-5 副溶血弧菌与痢疾志贺菌的OmpW蛋白质序列比对图Query:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct:C.Shigella dysenteriae Sd197的OmpW蛋白质序列图2-6 副溶血弧菌与嗜水气单胞菌的OmpW蛋白质序列比对图Query:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct:Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila ATCC 7966的OmpW蛋白质序列；图2-7 副溶血弧菌与syringae假单胞菌的OmpW蛋白质序列比对
15、图Query:V.parahaemolyticus RIMD 221063的OmpW蛋白质序列；Sbjct:Pseudomonas syringae pv.tomato NCPPB 1108的OmpW蛋白质序列13多元弧菌种内和种间多元弧菌种内和种间OmpW蛋白质序列的蛋白质序列的高度保守性高度保守性 弧菌和非弧菌弧菌和非弧菌OmpW蛋白质序列的较大差蛋白质序列的较大差异性异性 单克隆抗体本身具有单克隆抗体本身具有的识别单一抗原决定的识别单一抗原决定簇、特异性强的优良簇、特异性强的优良特性特性 为后续工作筛选到可特异性识为后续工作筛选到可特异性识别多元弧菌、而与非弧菌无交别多元弧菌、而与非弧菌
16、无交叉反应的抗叉反应的抗OmpW单克隆抗体单克隆抗体建立了理论基础建立了理论基础 第二章第二章 多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析多元弧菌三种外膜蛋白的生物信息学分析 14第三章第三章 副溶血弧菌副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达基因的克隆与表达15第三章第三章 副溶血弧菌副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达基因的克隆与表达3.2 ompW基因的克隆基因的克隆 图图3-1 副溶血弧菌目的基因副溶血弧菌目的基因ompW的的PCR产物电泳图产物电泳图1.DNA marker；2,3,4.Vp 1.1997、Vp 86和Vp 87的ompW基因扩增产物.以提取的副溶血弧菌Vp 1.1997，Vp 86，Vp 87基因组DNA为模板，分别扩增OmpW成熟蛋白的编码基因序列。将PCR产物分别上样1%琼脂糖凝胶，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察扩增后的产物，结果显示三株菌株对应的泳道均出现了约600bp的特异性扩增条带。16第三章第三章 副溶血弧菌副溶血弧菌ompW基因的克隆与表达基因的克隆与表达3.3 重组质粒的构建及鉴定重组质粒的构建及鉴定 图图3-2 重组质粒的重组质粒的PCR产物及双酶切产
