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1、1定量定量PCR基本原理及方法基本原理及方法2一一 荧光定量荧光定量PCR基本原理基本原理二二 荧光定量荧光定量PCR标记方法标记方法三三 荧光定量荧光定量PCR不同方法学的应用不同方法学的应用内 容内 容3 定量定量PCR技术的产生技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度核酸 染料荧光后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB一一荧光定量荧光定量PCR基本原理基本原理4Real-time ChemistriesPCR的的理论方程：理论方程：Y=x(1+Ev)n Y：扩增物数量；X：起
2、始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数1.终点法定量原理终点法定量原理前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即：lnx=lnY-nln(1+Ev)=lnY-b(b为常数)2.实时检测法定量原理实时检测法定量原理前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgYnLg(1+Ev)=b-na (a、b为常数)荧光定量荧光定量PCR的定量原理的定量原理5阈值阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值。阈值（阈值（thres
3、hold）的设定）的设定PCR efficiency=10(-1/slope)-1Where slope=1/mSlope -3.322100%efficiencyPCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。Ct值值n：扩增循环数：扩增循环数 n:扩增循环数扩增循环数的确定的确定6logN=log N0+nlogE n=Ct每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该
4、样品的起始拷贝数。Ct值值与起始模板的关系与起始模板的关系Y轴Ct值X起始拷贝数的对数7标准曲线标准曲线 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 计算待测样品的初始模板浓度log N0=-Ct logE+logN 绝对定量绝对定量未知浓度的样品与标准曲线相比较未知浓度的样品与标准曲线相比较8l 内掺式染料内掺式染料 SYBR Green I,LC Greenl 序列特异性探针序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons FRETl 引物特异性探针引物特异性探针Amplifluor(Intergen)LUX二二荧光定量荧光定量 PCR 标记方法标记方法95353SGExcita
5、tionSGSGSGSGEmission 105353SGSGSGSGSGExcitationEmission 11RQ53535353ExcitationRQQRQRExcitation12RQExcitationRQQRExcitationEmission13Oligo 1:FluoresceinOligo 2:LC Red 640ExcitationEmissionTransfer14三三荧光定量荧光定量PCR不同方法学的应用不同方法学的应用 研究目的研究目的 标记方法标记方法15l 定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量）定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相
6、对定量）Sybr-Green(LC Green),Taqman,Molecular Beacon,etc 研究目的研究目的l 基因型分析（基因型分析（SNP、突变型分析）、突变型分析）Taqman,Molecular Beacon,FRET,LC Greenl 熔解曲线分析熔解曲线分析 Sybr-Green,LC Green,Molecular Beacon,FRET16某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达检测结果 （自备标准品，检测样品做复管）l 绝对定量绝对定量17某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用Ct法得出的分析结果。（自备
7、标准品，检测样品做3次重复复管）HouseKeeper GeneGene of Interestl 相对定量相对定量18利用溶解曲线进行实验条件的优化（RG3000）l 熔解曲线分析熔解曲线分析deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT.35.3.25.2.15.1.05Bin ABin BAnnealing at 60deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT1.21.11.9.8.7.6.5.4.3.2.10Bi
8、n AAnnealing at 6319 标记方法标记方法l Taqman 定量分析，基因型分析l Sybr-Green 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析(LC Green)l Molecular Beacon 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析l FRET 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析l Ampliflour Probe，LUX 定量分析20 基因型分析基因型分析l 利用扩增信号的种类来分型利用扩增信号的种类来分型 Taqmanl 根据熔解曲线的不同来分型根据熔解曲线的不同来分型 FRET,Molecular Beacon LC Green21双Taqman探针法检测野生型和突变型
9、在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，则样本为杂合型。l 利用扩增信号的种类来分型利用扩增信号的种类来分型杂合型野生型突变型22 FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型 FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时，FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。l 利用熔解曲线检测基因突变利用熔解曲线检测基因突变杂合型野生型突变型23利用内掺式染料进行高分辨率熔解曲线（HRM）分析基因型HRM根据序列长度、GC含量和互补性分析样品，可精确到单碱基差异。相比其它方法节约了探针和标记的费用。上图：用内掺式染料（无探针）区分ACTIN3（R577X）SNP基因型（C到T替代）。同源野生型、突变型及杂合样品如图所示（10次重复），由随机软件自动分型。片段预先进行40个循环的快速扩增（40分钟）。l 利用熔解曲线检测基因突变利用熔解曲线检测基因突变
