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1、本章目录26.1重组药物概述26.2重组药物的通用制造方法与技术26.3重组药物的分离纯化技术关键26.4重组药物的质量控制26.5典型重组药物制造技术及工艺26.1重组药物概述 20世纪70年代建立的DNA重组技术带来了生物技术新的变革，促进了以基因工程技术为核心的现代生物技术的诞生和发展，被认为是20世纪人类的一项最伟大的贡献。DNA重组技术，亦称基因重组技术，是指将DNA片段（如基因）按人们的设计方案定向地与载体相连，并转入特定的受体细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。应用DNA重组技术表达和生产的多肽或蛋白质类药物，称为重组
2、药物。26.1重组药物概述 应用DNA重组技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化及结构等进行深入的研究和开发应用，还可以对已有的药物进行改造，克服其不足，创造自然界不存在的全新物质。目前，采用DNA重组技术生产的药物主要有干扰素、生长素、胰岛素、重组疫苗等。重组药物制造的通用方法流程为：获得目的基因；将目的基因和载体连接，构建DNA重组体；将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产物的检验和制剂制备等。26.2重组药物的通用制造方法与技术 对于各单元操作可参考前面各章节叙述，在操作过程中在操作过程中需注
3、意：需注意：1、操作条件要温和，能保持目的产物的生物活性；2、选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高的纯化倍数；3、收率要高；4、两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理调整，这样可以减少工艺步骤；5、整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。重组药物分离纯化的一般流程为：重组药物分离纯化的一般流程为：固液分离、细胞破碎、提取、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工等。26.3重组药物的分离纯化技术关键 构建好的基因工程菌在适当条件下培养发酵，表达重组药物后，还需选择适当的分离纯化方法将产物提纯，制成特定的制剂，才能被应用于临床。重组药物结构上多为
4、活性肽或蛋白质，稳定性差，对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易失活、变性。而且基因工程菌培养发酵产物中含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，而目的产物在初始物料中含量较低，同时重组药物一般都需注射给药，对其质量、纯度要求高，如需无菌、无热源等。为获得合格的目的产物，必须建立与上述特点相适应的分离纯化工艺。分离纯化重组药物须重点考虑下列几个技术因素：1.产物的表达形式2.根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型3.分离单元之间的衔接4分离纯化工艺的要求1.产物的表达形式 根据外源基因表达产物在宿主细胞中的定位，可将表达方式分为分泌型表达和胞内表达。外源蛋白的分泌表
5、达是通过将外源基因融合到编码信号肽序列的下游来实现的。将外源基因接在信号肽之后，表达产物在信号肽的引导下跨膜分泌出胞外，同时在宿主细胞膜上存在特异的信号肽酶，它识别并切掉信号肽，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。分泌型表达产物的发酵液的体积很大，但浓度较低，因此必须在纯化前富集或浓缩，通常可以用吸附、沉淀或超滤的方法来进行富集或浓缩。如果表达产物前没有信号肽序列，它可以可溶形式或不可溶形式（包涵体）存在于细胞中。对于胞内产物，首先要通过离心或过滤的方式收集细胞，并采用适当的方法破壁。在工业生产中常用大肠杆菌作为宿主菌来生产目的蛋白，在大肠杆菌中当外源蛋白的表达量达到20%以上时，它们一般
6、就会以包涵体（inclusion body）的形式存在。外源蛋白的复性是利用包涵体获得外源蛋白最关键也是最复杂的一步。重组蛋白的复性操作主要有两种方法：一种是将溶液稀释，导致变性剂的浓度降低，促进蛋白质复性。如果蛋白质以胞内可溶表达形式存在，则收集菌体后破壁，离心取上清液，然后用亲和层析或离子交换法进行纯化。在纯化过程中还常采取适当的保护措施，如低温、加入保护剂、尽量缩短纯化工艺及时间等措施来防止产物的降解和破坏。另外表达产物还可存在于大肠杆菌细胞周质中，这是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。大肠杆菌经低浓
7、度溶菌酶处理后，可采用渗透冲击的方法来获得周质蛋白。缺点是渗透冲击的方法破壁不完全，产物的收率较低。2.根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型 基因工程产物常需采用层析来进行精制以达到药用标准。在选择层析类型和条件时要综合考虑蛋白质的性质。如蛋白质的等电点和表面电荷的分布及目的蛋白质的稳定性。亲和层析亲和层析是一种高效的分离纯化手段，不同的蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基，如酶和底物、抗原与抗体、糖链和凝集素等。一般是目的蛋白与配基结合而杂蛋白不结合，目的蛋白吸附后再利用快速变换洗脱液和加入竞争剂的方法进行洗脱。由于亲和分离的选择性强，因此在产物纯化中具有较大的潜力；疏水作用层析和反相作用层析是
8、利用蛋白质疏水性的差异来分离纯化蛋白质。二者的不同在于疏水作用层析通常在水溶液中进行，蛋白在分离过程中仍保持其天然构象，而反相作用层析是在有机相中进行，蛋白经过反相流动相与固定相的作用有时会发生部分变性；凝胶排阻层析根据蛋白质的相对分子质量以及蛋白质分子的动力学体积的大小来进行分离的，它可应用于蛋白质脱盐和蛋白质分子的分级分离。3.分离单元之间的衔接 考虑到工业生产成本，一般早期尽可能采用高效的分离手段，如通常先用非特异、低分辨的操作单元方法（如沉淀、吸附、超滤等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质；然后采用高分辨率的操作方法（如离子交换色谱、亲和色谱等），而将凝胶排阻色谱这
9、类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，以提高分离效果。当几种方法连用时，最好以不同的分离机制为基础，而且经前一种方法处理样品应能适合于作为后一种方法的料液。如果经盐析后得到的产品，不适宜于离子交换层析，但可直接应用于疏水层析。离子交换、疏水及亲和色谱通常可起到蛋白质浓缩的效应，而凝胶过滤色谱常常使样品稀释，在离子交换色谱之后进行疏水层析色谱就很合适，不必经过缓冲溶液的更换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质结合较强。亲和层析选择性最强，但不能放在第一步，一方面因为杂质多，易受污染，降低使用寿命；另一方面，体积较大，需要大量的介质，而亲和层析介质一般较贵。因此亲和层析多放在第二步以后。
10、有时为了防止介质中毒，在其前面加一保护柱，通常为不带配基的介质。经过亲和层析后，还可能有脱落的配基存在，而且目的蛋白质在分离和纯化过程中会聚合成二聚体或更高的聚合物，特别是当浓度较高，或含有降解产物时更易形成聚合体，因此最后需经过进一步纯化操作，常使用凝胶过滤色谱，也可用高效液相色谱法，但费用较高。4分离纯化工艺的要求 在重组药物分离纯化过程中，通常需要综合使用多种分离纯化技术。另外，作为药品，其生产必须保证安全、无菌、无热源、无污染。1、分离纯化工艺要求有良好的稳定性和重复性，减小原料及设备对产品的影响。2、工艺的步骤尽可能少，时间要尽可能短，以减少生物活性物质的破坏失活。2、组成工艺的各技
11、术、步骤之间及设备间要能相互适应和协调，且高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低，并尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质量。26.4重组药物的质量控制 重组药物与其它传统方法生产的药品有许多不同之处，它利用活细胞作为表达系统，并具有复杂的分子结构。它的生产涉及到生物材料和生物学过程，如：发酵、细胞培养、分离纯化目的产物，这些过程有其固有的易变性。同时由于重组技术所获得的蛋白质产品往往在极微量下就可产生显著效应，任何药物性质或剂量上的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害。因此，对重组药物产品进行严格的质量控制是十分必要的。重组药物的质量控制包括原材料原材料、培养过程培养过程、
12、纯化纯化工艺过程工艺过程和最终产品质量控制最终产品质量控制。原材料质量控制往往采用细胞学、表型鉴定、抗生素抗性检测、限制性内切酶图谱测定、序列分析与稳定性监控等方法。1.需明确目的基因的来源、克隆经过，提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物等；2.应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性等；一、原材料质量控制一、原材料质量控制 3.还需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；4.提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷
13、酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。在培养过程的质量控制上，要求种子克隆纯而且稳定，在培养过程中工程菌不应出现突变或质粒丢失现象。生产重组药物应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。原始种子批需确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。对菌种最高允许的传代次数、维持培养时间等也必须做详细说明。二、培养过程的质量控制二、培养过程的质量控制 在纯化工艺过程的质量控制上，要考虑到尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖及
14、其它杂质，并避免在纯化过程带入的有害物质。如用柱层析技术应提供所用填料的质量认证证明，并证实从柱上不会掉下有害物质。上样前应清洗除去热源等。纯化工艺的每一步均应测定纯度，计算提纯倍数、收率等。纯化工艺过程中应尽量不加入对人体有害的物质，若不得不加时，应设法除净，并在最终产品中检测残余量，应远远低于有害剂量，同时还要考虑到多次使用的积蓄作用。三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制 目前有许多方法可用于对重组技术所获得蛋白质药物进行全面鉴定鉴定，如用各种电泳技术分析、高效液相色谱分析、肽图分析、氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析及免疫学分析的方法等。四、对最终产品的质量控制主要包括产
15、品的鉴产品的鉴 别别、纯度纯度、活性活性、安全性安全性、稳定性稳定性和一致性一致性。对其纯度测定通常采用的方法有还原性及非还原性SDS-PAGE、等电聚焦、各种HPLC、毛细管电泳等，需有两种以上不同机制的分析方法相互佐证，以便对目的蛋白质的质量进行综合评价；在其杂质控制上要检测内毒素、热原、宿主细胞蛋白、残余DNA等。对其生物活性生物活性需采用国际或国家参考品，或经过国家鉴定机构认可的参比品，以体内或细胞法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位；在安全性上需按照“中国生物制品规程”进行无菌试验、热原试验、毒性和安全试验。由于蛋白质结构十分复杂，可能同时存在多种降解途径，因此须在实际条件下长期
16、观测稳定性，对产品一致性、纯度、分子特征和生物效价一致性、纯度、分子特征和生物效价等多方面的变化情况加以综合评价，确定产品的贮藏条件和使用期限等。26.5典型重组药物制造技术及工艺 下面介绍几种临床上极为重要的重组药物如干扰素、生长素、胰岛素等的生产技术及工艺。26.5.1重组人干扰素生产技术及工艺26.5.2重组人胰岛素生产技术及工艺26.5.3重组人生长素生产技术及工艺26.5.4重组人促红细胞生成素生产技术及工艺26.5.1重组人干扰素生产技术及工艺26.5.1.1 重组人干扰素概述 干扰素（interferon，IFN）是机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。根据干扰素来源及其基因序列和氨基酸组成不同，可将干扰素分为型和型。型干扰素的表达细胞来源类似，包括干扰素-、和。用病毒等刺激外周血浆样树突细胞（pDCs）可以产生干扰素-、的13种亚型，3种干扰素-亚型和干扰素-，但是没有型干扰素-。干扰素的生物学活性相当广泛，主要包括广谱抗病毒活性、直接抗肿瘤活性和免疫调节活性。1.干扰素抗病毒作用的
