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1、2023欧洲疾病预防控制中心百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测解读摘要百日咳是一种极具传染性的急性呼吸道感染性疾病，尽管已广泛开展了儿童疫苗接种，但并不能由此获得终身免疫。为应对百日咳在世界流行的挑战，2022年12月21日欧洲疾病预防控制中心发布了百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测，详细描述了百日咳实验室诊断和分子监测的方案，值得我国从事百日咳诊疗的医护人员和技术人员研究学习，现介绍并解读该文件的主要内容。关键词百日咳鲍特菌；实验室诊断；分子监测百日咳是由百日咳鲍特菌(8ode/aPess/M)引起的具有高度传染性的呼吸道疾病,全年龄段人群均可感染发病。自20世纪50年代起，随着百日咳疫苗的
2、广泛接种，百日咳发病率显著降低，但近年来，一些疫苗接种率较高的国家和地区相继报道百日咳发病率逐渐上升，称为百日咳再现【1。但国家之间监测的百日咳流行病学变化特征并不一致，不同国家推广的百日咳检测方法和应用策略存在显著差异21,削弱了百日咳发病数据之间的可比性。2022年12月21日欧洲疾病预防控制中心(EuropeanCentreforDiseasePreventionandControl,ECDC)发布了百日咳鲍特菌的实验室诊断和分子监测3),不仅详细描述了百日咳实验室诊断，包括细菌培养、核酸检测、抗原鉴别以及血清鉴定的方法，而且对相关的分子监测，如抗原序列分析和基因组测序等方法加以阐述，值
3、得我国从事百日咳诊疗的医护人员和技术人员研究学习，本文介绍并解读该文件的主要内容。1标本的采集与转运百日咳鲍特菌主要在人的鼻咽部生长繁殖，可从鼻咽拭子(nasopharyngealSWab,NPS)或鼻咽抽吸物(nasopharyngealaspirate,NPA)标本中分离。NPA是临床上常见的呼吸道感染病原体检测标本，且可分成等份并保存，易于多个研究共享，但收集以门诊就诊为主的年长儿、青少年和成人的NPA标本较难，因此除了婴幼儿住院患者，NPS更易于采集。止匕外，由于需要患儿及其家属更长时间的配合，临床上采集到合格的NPA标本更为困难，相对而言，NPS采样更加方便快捷，接受度更高。因此，作
4、者所在团队2000年以来，一直采用NPS进行百日咳鲍特菌分离培养和核酸检测。NPS采样技术在新型冠状病毒病疫情期间也得到了推广和普及。用于百日咳鲍特菌分离培养和特异核酸检测标本最佳的采集时间为咳嗽出现后的3周内ML世界卫生组织推荐咳嗽病程1个月内适宜百日咳病原学诊断【5】。如有可能，室温下采集的拭子应立即接种，如需转运，4h内运送到微生物实验室进行培养；如置于含有木炭的ReaganLowe(RL)、Amies培养基中或通用运输培养基中可适当放宽转运时间。建议高温季节时采用冰盒转运。2实验室诊断2.1细菌培养与成人相比，儿童(尤其是婴儿)患者的NPS中百日咳鲍特菌DNA含量更高，因此，百日咳婴幼
5、儿一般采用细菌培养或核酸扩增的方法辅助诊断。对咳嗽持续时间21d的百日咳疑似病例采集NPS,并划线接种到补充有15%去纤维蛋白绵羊血或马血的新鲜RL或鲍-金培养基(Bordet-Gengoumedium,BG),RL和BG平板上的百日咳分离率相似。BG的主要优点是观察溶血更为方便。由于百日咳鲍特菌为苛养型革兰阴性球杆菌，且生长速度慢，因此通常要加入选择性培养基添加物-头抱氨节以抑制其他细菌的生长。接种标本的平板应置于35-36有氧条件下培养7d,并每天检视,3d后若见灰白色、圆形、半透明水银滴样的细小疑似菌落，可以采用特异性血清凝集试验或聚合酶链反应(PCR)加以鉴定，也可以借助基质辅助激光解
6、吸电离飞行时间质谱进行确认。过夜培养就可见的疑似菌落可能是副百日咳鲍特菌，也应进行鉴定确认。培养7d后没有可疑菌落生长的平板可以培养阴性处理。为避免平板干燥，孵箱内需保持湿度在60%左右。传统的细菌培养，虽然检测特异度高，也可以用于评估其抗生素的耐药性，但由于操作的复杂性，结果容易受到标本的采取手法，实验室的培养条件等因素的影响，其阳性检出率低。2.2核酸检测核酸检测受抗生素使用的影响较细菌培养小，咳嗽病程短于4周(256mg/L或纸片抑菌直径35mm0大环内酯类耐药机制是百日咳鲍特菌23SrRNA基因结构域V中2047位(A2047G)核昔酸A改变为G的点突变。3.3脉冲场凝胶电泳2000年，百日咳领域的专家基于XbaI和SPel两种酶建立了百日咳鲍特菌的脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)的参考方法211,用来分析分子大小在23和500kb之间的条带，具体信息可以参考网站：http:/www.pasteur.fr/recherche/unites/Bordetella/Analysis.html一项2012年至2015年的研究在欧洲百日咳鲍特菌中发现了PFGE谱型发生明显变化，BpSR3(29.4%)和BPSRIo(27.2%)变得普遍，而以前占主导地位的BpSR11和其他谱的数量和占比下降22。PFG
