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1、活体生物体内成像技术活体生物体内成像技术In Vivo Imagine Technology国家生物医学分析中心国家生物医学分析中心活体生物体内检验是生物研究的最终验证活体生物体内检验是生物研究的最终验证 体外试验体外试验（In Vitro）分子生物学技术分子生物学技术 克隆技术克隆技术 蛋白组学蛋白组学 等等等等 活体生物体内成像活体生物体内成像（In Vivo Imaging Technology）体内反应体内反应（In Vivo）研究方法受体内环研究方法受体内环境制约，很难准确境制约，很难准确反映体内情况反映体内情况 体外检验体外检验（Ex Vivo）PCR 电泳电泳 组织病理学组织病理
2、学 肿瘤称量肿瘤称量 等等等等目前的活体生物体内成像技术和方向目前的活体生物体内成像技术和方向l 超声超声（UltrasoundUltrasound）l 计算机断层摄影计算机断层摄影（Computed Tomography Computed Tomography，CTCT）l 核磁共振核磁共振（Magnetic Resonance Imaging Magnetic Resonance Imaging，MRIMRI）l 正电子衍射成像正电子衍射成像（Positron-Emission TomographyPositron-Emission Tomography，PETPET）l 单光子衍射单光子
3、衍射(Single-Photon-Emission Computed Tomography,SPECT(Single-Photon-Emission Computed Tomography,SPECT)l 可见光及荧光成像可见光及荧光成像(Optical Imaging with(Optical Imaging with visible light and Fluorescencevisible light and Fluorescence）-生物发光生物发光 （BioluminescenceBioluminescence）与荧光与荧光（FluorescenceFluorescence）几种常
4、用活体体内成像技术的比较几种常用活体体内成像技术的比较结构成像结构成像功能成像功能成像操作复杂操作复杂操作简单操作简单MRI核磁共振核磁共振Optical Imaging可见光成像可见光成像PET/SPET正电子衍射正电子衍射Ultrasound超声超声CT活体成像系统活体成像系统专门为检测活体动物体内发光而设计的技术专门为检测活体动物体内发光而设计的技术 生物体内成像系统生物体内成像系统使研究人员能够直接监使研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞控活体生物体内的细胞活动和基因行为。活动和基因行为。理想的光源：萤火虫或细菌荧光素酶（理想的光源：萤火虫或细菌荧光素酶（luciferase）基因、
5、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。精诺真活体成像系统原理精诺真活体成像系统原理遗传学标记遗传学标记实时、原位实时、原位多波长检测多波长检测标记癌细胞标记癌细胞标记细菌标记细菌标记转基因鼠标记转基因鼠 基因、细胞和活体动物都基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术生物学克隆技术,将荧光素酶将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选术的筛选,培养出能稳定表达培养出能稳定表达荧光素酶
6、的细胞株。荧光素酶的细胞株。荧光素酶的表达（荧光素酶的表达（1）将将荧光素酶荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使合到细胞染色体内，使荧光素荧光素酶得到持续表酶得到持续表达。达。启动子启动子染色体染色体体内表达体内表达外源注入底物外源注入底物活跃细胞活跃细胞体内发光体内发光 荧光素酶的底物荧光素酶的底物荧光素，为约荧光素，为约280道尔顿的小分道尔顿的小分子。荧光素脂溶性非常好子。荧光素脂溶性非常好,很容易透过血脑屏障。注射很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45
7、分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子，分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子，这是肉眼无法观察到的，先进的成像系统，应用一个高这是肉眼无法观察到的，先进的成像系统，应用一个高度灵敏的制冷度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软相机及特别设计的成像暗箱和成像软件，可观测并记录到这些光子。件，可观测并记录到这些光子。LuciferinluciferaseDecanal Lux operon FMNH2+Promoter luxA luxB luxC luxD luxE发光发光荧光素酶的表达（荧光素酶的表达（2）：细菌荧光素酶）：细菌荧光素酶（Photorhabdus lumines
8、cens）活体成像系统活体成像系统 生物学生物学标记基因标记基因物理学物理学软件软件 成像成像数据分析数据分析Living Image 成像及数据分析软件成像及数据分析软件 IVIS50 Imaging System 在波长大于在波长大于600nm时，由老鼠体内发出的光是可时，由老鼠体内发出的光是可以穿透皮肤被检测到。以穿透皮肤被检测到。标准图像的组成标准图像的组成 当前肿瘤研究的主当前肿瘤研究的主要方法还主要局限于肉要方法还主要局限于肉眼观察、处死老鼠后的眼观察、处死老鼠后的肿瘤体积测量、称重及肿瘤体积测量、称重及组织学切片观察等。组织学切片观察等。传统肿瘤模型传统肿瘤模型传统实验方法与活体
9、成像方法比较传统实验方法与活体成像方法比较结果显示：肿瘤的大体积与生物发光强度呈线性相关结果显示：肿瘤的大体积与生物发光强度呈线性相关Brian Ross,Ph.D.University of Michigan Medical center.核磁共振与活体成像技术比较核磁共振与活体成像技术比较安慰剂作安慰剂作用天数用天数生物发生物发光强度光强度平均肿瘤体积平均肿瘤体积平平均均光光子子数数对对数数值值生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关1x101x106 6 ，PC-3M-LucPC-3M-Luc肿瘤细胞肿瘤细胞，皮下注射皮下注射精诺真具有高度灵敏性精诺真具有高度灵敏
10、性Images courtesy of Contag et al,Stanford University可精确观可精确观察到察到100个个细胞细胞1001011021031040100101102103104105细胞数细胞数100101102103104细胞培养中平均光子数细胞培养中平均光子数/秒秒(x103)小鼠体内平均光子数小鼠体内平均光子数/秒秒(x105)1x1035x1030 2510number of cells/well432x1045x1042x1035x1040101102103104105number of cells/animal荧光强度与标记细胞数目呈线性相关荧光强度
11、与标记细胞数目呈线性相关活体成像技术的主要应用活体成像技术的主要应用免疫学、代谢、发育、内分泌学，免疫学、代谢、发育、内分泌学，等等等等B16-F10 luc+肿瘤细胞尾部肿瘤细胞尾部静脉注射后静脉注射后2分钟的成像分钟的成像 癌症及药物研究癌症及药物研究 病毒学及基因治疗病毒学及基因治疗 转基因动物模型转基因动物模型 蛋白质相互作用蛋白质相互作用 siRNA研究的应用研究的应用 干细胞干细胞 其它其它 细胞凋亡细胞凋亡Oncology Applications 癌症研究的应用体内药物分析的生物发光检测体内药物分析的生物发光检测1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞肿瘤细胞，皮下注射皮下注射
12、14天天21天天28天天35天天处理方式处理方式 细胞数细胞数无治疗对照无治疗对照 2.2x1095-FU治疗治疗 2.8x108丝裂酶素治疗丝裂酶素治疗3.6x106小鼠小鼠#6 n=7 小鼠小鼠#40 n=8 (从第从第11天开始给药天开始给药)小鼠小鼠#31 n=8 (从第从第11天开始给药天开始给药)静脉注射治疗起始点静脉注射治疗起始点Exp#049雄性雄性SCID小鼠小鼠对照对照 n=5-8丝裂酶素丝裂酶素C n=4-85-FU n=8 (5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶)实验天数实验天数生物发光数生物发光数检测体内药物治疗检测体内药物治疗1x106 ，PC-3M-Luc肿瘤细胞肿瘤细胞，皮下注
13、射皮下注射对照组于第对照组于第五周结束观五周结束观察察n=13n=6/7生物发光强度生物发光强度 Exp#081 雄性雄性nu/nu CR n=13,5,7生物发光检测体内药物治疗的复发作用生物发光检测体内药物治疗的复发作用5x105 ，PC3M-Luc-C6肿瘤细胞，原位前列腺癌模型肿瘤细胞，原位前列腺癌模型1周周3周周5周周7周周8周周生理盐水对照组生理盐水对照组 （小鼠（小鼠#40）静注，静注，3次次/周，周，第二、三周第二、三周 5-Fu治疗组治疗组 (小鼠小鼠#38)100 mg/kg 静注，静注，1次次/周，周，第二、三、四周第二、三、四周 丝裂酶素治疗组丝裂酶素治疗组 （小鼠（小
14、鼠#4）2mg/kg 静注，静注，3次次/周，周，第二、三周第二、三周组织病理学观察组织病理学观察第第20天天实验性骨转移瘤模型实验性骨转移瘤模型皮下注射皮下注射PC-3M-LucVirology Applications细菌及病毒学研究应用以及在以以及在以DNADNA为基础的基因治疗研究的应用为基础的基因治疗研究的应用不同肺炎链球菌菌株感染模式研究不同肺炎链球菌菌株感染模式研究 TIGR4Xen35 A66.1Xen10 D39Xen7 1.0108 1.0 107 1.0 107 24 48 72 96hrs 2500200015001000500Orihuela CJ,St.Jude C
15、hildrens Research Hospital,Scand J Infect Dis.,2003.单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒(HSV)在在 干扰素干扰素(IFN)受体敲除小鼠的感染实验受体敲除小鼠的感染实验 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4Wild-type IFNgR-/-IFNabR-/-IFNabgR-/-Luker et al,Washington University School of Medicine,J.Virol.,2003siRNA 阻断RNA 研究的应用当共转染当共转染 pGL3-luc 或或HCV-luc 表达载体特异的表达载体特异的
16、siRNA时，时，可抑制报告基因可抑制报告基因Luciferase的表达的表达McCaffrey et al,Stanford University School of Medicine,Nature,2002抑制荧光素酶抑制荧光素酶(pGL3-control)抑制丙型肝炎病毒抑制丙型肝炎病毒(pShh1-Ff1)Stem Cell Research干细胞研究的应用研究干细胞造血作用研究干细胞造血作用Cao et al,Stanford University School of Medicine,PNAS,2004 80706050403020100Total leukocytesGranulocytesB cellsT cells活体内蛋白质活体内蛋白质-蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用lLUC N端端 与与 C端端 分开时并不发光分开时并不发光l蛋白质蛋白质A 与蛋白质与蛋白质B 分别与分别与LUC N端端 和和 C端端 连接连接l两组蛋白质由不同的质粒诱导表达两组蛋白质由不同的质粒诱导表达蛋白蛋白ALuc N端端蛋白蛋白BLuc C端端蛋白蛋白A蛋白蛋白BLucifera
