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1、ICSILo40.40CCSC45团体标准T/CSBMXXXX-XXXX涂层抗凝血性能体外试验方法Testingmethodforanticoagulationpropertiesofcoatinginvitro（征求意见稿）XXXX-XX-X 发布XXXX-XX-XX 实施中国生物材料学会发布目次弓I言I范围2规范性引用文件3术培和定义4试验方法4.1通则4.2蛋白质吸附测试4.3血小板黏附试验34.4凝血时间.44.5体外血栓测试45报告4参考文献6前言本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件
2、的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中国生物材料学会提出。本文件由中国生物材料学会团体标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏百赛飞生物科技有限公司、百因特表界面检验检测技术（苏州）有限公司、四川大学、四川医疗器械生物材料和制品检验中心有限公司、深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）、山东省医疗器械和药品包装检验研究院、苏州大学、苏州工业园区生物材料表界面工程研究院。本文件主要起草人：李丹、陈益平、梁洁、袁瞰、王书暗、刘成虎、方菁嶷、陈红。本文件首次发布。引言心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高血脂、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出
3、血性疾病。据统计，全世界每年死于心脑血管疾病的人数居各种死因首位，严重威胁着人类的健康及生命安全。随着现代医学的发展，越来越多的血液接触类医疗器械被应用于心脑血管类疾病的治疗。器械在使用过程中往往会因为非生理性血流剪切力、低速流、流动滞止等流动因素和非自体的机械结构因素，血浆蛋白质首先会瞬间在器械材料表面吸附形成血浆蛋白，然后血小板会在血浆蛋白表面黏附、聚集，进而使血小板激活、凝血级联及补体激活，最终导致血栓形成。现代医学发展至今，尽管历经数十年的研究与实践，仍未能开发出种具有持久血液相容性的材料，而材料表面引发的凝血或血栓问题一克是血液相容性问题中最普遍也是最严重的，病人在使用这些器械的过程
4、中，绝大多数情况仍需同步辅以抗凝药物，但即便如此,仍然无法完全避免血栓在材料表面生成，且会增加出血的风险。因此，在材料/器械表面设计及构建安全和有效的抗凝血表面涂层为这一问题的解决提供了思路，能有效避免材料表面发生凝血和血栓的形成。然而，国内带抗凝涂层医疗器械的研究和发展刚刚起步，对于抗凝涂层的功能性和安全性评价研究也十分匮乏，尚没有适用于血液接触类医疗器械涂层抗凝性的体外检测标准及监管措施，企业多是采用动物实验或临床试验结果来进行评价，大大增加了企业的研发和时间成本，尤其是在原材料筛选和研发过程中，无法得到快速的响应，严重不利于创新产品的快速研发和迭代。因此，建立统一的血液接触类医疗器械涂层
5、抗凝血性能体外试验方法十分必要，有助于规范和监督医疗器械涂层市场的健康持续发展，最终推动整个医疗器械行业和人类健康产业的高品质发展。涂层抗凝血性能体外试验方法1范围本文件规定了涂层抗凝血性能体外试验方法，包括蛋白质吸附测、成、血小板黏附试验、凝血时间和体外血栓测试四种方法。本文件适用于通过强结合力均匀固定在材料或器械表面的抗凝涂层。本文件不适用于能从表面快速洗脱或释放的涂层.2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBrr16886.1
6、2医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料YYfT1649.1医疗器械与血小板相互作用试验第1部分：体外血小板计数法YY1911医疗器械凝血试验方法ASTMF2382-18StandardTestMethodforAssessmentofCirculatingBlood-ContactingMedicalDeviceMaterialsonPartialThromboplastinTime(PTT)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1抗凝涂层AntiCoagUlantCOating通过一定的强结合力均匀涂覆在器械表面的具有抗凝血功能的物质。3.2抗凝血性能Anticoagula
7、tionproperties器械表面涂层具有阻止或抑制血栓形成的能力4试验方法4.1通则本文件推荐了用于表征涂层抗凝血性能的体外试验方法，包括蛋白质吸附测试、血小板黏附试验、凝血时间和体外血栓测试四种方法。也可采用经验证的其他方法。4.2蛋白质吸附测试4.2.1试验概述当血液与医疗器械接触时，器械表面会迅速的吸附上纤维蛋白原等血浆蛋白，吸附的血浆蛋白会进一步造成血小板的大量黏附，最终导致凝血的形成。因此，评估吸附在器械表面血浆蛋白的吸附情况，可作为判断涂层抗凝性能的重要指标。4.2.2方法一4.2.2.1试验原理通过ELISA间接法，样品表面吸附一定量的纤维蛋白原(Fg)作为抗原，将吸附Fg的
8、样品先与特异性的纤维蛋白原抗体结合，然后再加入酶标记的二抗进行反应，形成复合物。最后通过底物反应产生显色信号来检测样品上吸附的Fg的含量。4.2.2.2试验步骤样品在纤维蛋白原(Fg)溶液中浸泡吸附后洗去表面未牢固吸附的Fg,然后依次与纤维蛋白原抗体和带有酶标记的二抗特异性结合，加入显色剂和终止液后，测试在450nm处的吸光度值，通过与无涂层的同种材料样品比较，间接反映有无涂层样品对Fg吸附量的差异。注：制备体积较大或较厚的涂层材料时，应注意尽量减少切割面的暴露。4.2.3方法二4.2.3.1试验原理在碱性环境下，蛋白质分子中肽键结构与Ci?+络合并将C/+还原成CM.。二哇麻甲酸(BCA)特
9、异地与CUH结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处的吸光度与一定范围的纤维蛋白原(Fg)浓度呈线性关系，通过建立Fg浓度-吸光度标准曲线，计算样品吸附的蛋白质浓度。4.2.3.2试验步骤将Fg用PBS缓冲溶液配置成至少六个不同浓度的标准溶液，参照BCA蛋白浓度测定试剂盒的要求加入配置好的BCA工作液，然后在562nm处测试吸光度值，以Fg浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，采用线性方程进行拟合，R2需在0.995以上。取特定表面积的样品在Fg-PBS溶液浸泡吸附后洗去表面未牢固吸附的Fg,加入与Fg标准溶液相同体积的PBS缓冲溶液平衡，然后参照标准曲线试验步骤进行。将测试的吸光度值带
10、入标准曲线，计算得到蛋白浓度。通过与无涂层的同种材料样品比较，反映有无涂层样品对Fg吸附量的差异注1：不同材料会有不同的背景响应值，因此样品需进行未吸附Fg的测试获取背景数据。例如PVC、锻钛合金和PebaX等材料采用本方法时背景值较大，企业在选择方法时需结合材料特性充分考虑。注2：制备体积较大或较厚的涂层材料时，应注意尽量减少切割面的暴露.4.2.3.3结果分析按式(1)计算样品蛋白质的吸附量-U)Q=g%)u式中：Q-蛋白质吸附量，单位为微克（图）；CL样品吸附的蛋白浓度，单位为微克/毫升（国mL）：CL样品背景的蛋白浓度，单位为微克/毫升（Mg/mL）；一溶剂体积，单位为亳升（mL）。4
11、.2.4方法三4.2.4.1试验原理通过痕量标记蛋白的示踪技术来定量分析蛋白在基材表面上的准确吸附量。通过氯化碘（C1）将1阴离子氧化成为b单质，然后取代蛋白质酪氨酸残基苯环上羟基邻位的氢，从而将|25I标记于蛋白质。通过测量吸附在样品表面的放射量来表征蛋白的吸附量。4.2.4.2试验步骤通过I标记蛋白质，并将标记后的蛋白质溶液通过阴离子交换树脂柱以除去未反应的125I离子，通过测定125I标记的蛋白质溶液在280nm处的吸光值，除以吸光系数后得到标记蛋白溶液的浓度。将所述标记蛋白溶液按照比例与未标记蛋白溶液混合，视为125I蛋白质吸附液。将待测样品浸入您I蛋白质吸附液中，润洗并晾干后，用r计
12、数器测定待测样品表面的放射量。同时测定己知蛋白质含量的I蛋白质吸附液的放射量，从而定量表征样品表面蛋白质的吸附量。4.3血小板黏附试验4.3.1试验概述在凝血形成过程中，血小板的黏附和聚集扮演了重要的角色。黏附在器械表面的血小板活化后会释放大量促凝物质，并发生构象的变化，加速血小板的聚集和活化，从而使凝血反应急剧扩大。因此评估器械表面黏附血小板的形态和数吊：，也可作为判断涂层抗凝性能的重要指标。4.3.2试验步骤样品或对照材料与新鲜的抗凝全血或富血小板血浆（PRP）37匕下接触孵育后用0.9%氯化钠注射液多次轻轻涮洗，洗去表面非黏附的血小板。然后采用SEM观察、CD61荧光染色观察，或乳酸脱氢
13、酶（LDH）活性浓度测试（参照市售LDH活性检测试剂盒）等方式对样品表面黏附的血小板形态和数吊:进行观察和测试。孵育完样品后的全血或PRP也可进行血小板计数，比较样品接触前后的血小板的变化。注1：推荐采用健康成人新鲜血液进行试验，如采用其他动物血液，需验证其适宜性;注2：为尽可能模拟临床使用环境，建议优先采用ChandlerLp系统的方式进行动态孵肓。也可选择其他适宜的动态孵育方式。注3：孵育时长的选择根据样品临床用途和试验目的设定。4.4凝血时间4.4.1试验概述该试验主要适用于带肝素的抗凝涂层的医疗器械。肝素通过对抗凝血酶的激活阻断凝血反应，导致凝血时间延长。因此，比较产品接触血液后凝血时
14、间的变化，可以反映产品的抗凝效果。4.4.2试验步骤样品或对照材料和贫血小板血浆（PPP）直接接触，接触比例参照GBfr16886.12的规定，依次加入预热的兔脑磷脂和氯化钙溶液后，样品不取出，克接肉眼观察血浆中出现的冻状凝固物的时间（最长至5min）,用计时器以秒为单位记录。试验结果的计算、判定和有效性按YYZT1911要求执行。4.5体外血栓测试4.5.1试验概述医疗器械和全血直接接触后会吸附或黏附各类血浆蛋白和血细胞等，激活凝血途径，最终形成血栓。评估器械和全血接触后表面血栓的形成情况，可以反映产品的抗凝效果。4.5.2试验步骤样品或对照材料与新鲜的全血37七下接触孵育后用0.9%氯化钠
15、注射液多次轻轻涮洗，然后肉眼或显微镜观察器械表面形成的血栓情况，也可称量生成血栓的湿重或干重等指标。注1：推荐采用健康成人新鲜血液进行试验，如采用其他动物血液，需验证其适宜性。全血的选择有：非抗凝人体全血、抗凝人体全血、抗凝人体复钙化全血等；注2：为尽可能模拟临床使用环境，建议优先采用ChandlerLp系统的方式进行动态孵育。也可选择其他适宜的动态孵育方式。注3：孵育时长的选择根据样品临床用途和试验目的设定。5报告试验报告应包括但不限于下列各项内容：a）样品的识别；b）样品制备方法；c）测试方法；d）测试条件；e）测试结果。参考文献UlGB/T16886.4医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择2GB/T14233.2医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法Ywrl631.2输血器与血液成分相容性测定第2部分：血液成分损伤评定4TimLH,BhogalP,MarcusP,etal.HydrophilicStentCoatingInhibitsPlateletAdhesiononStentSurfaces:InitialResultsInVitroJ!.Cardiovascul
