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1、本实验课程以一个基因片段的获得,表达和纯化和活性分析为主线,抓住蛋白和核酸两大主眶,建立一个综合型和研究性的大实验教学体系,重视各项技术的衔接,启迪学生的科学思维和创新意识,提高学生对实验方法和实验技术的纱合运用能力课程设计的思路:一实验一、E.coli染色体DNA提取实验原理：溶菌能破壁蛋白酗K水解菌体核蛋白变性染色体DNA沉淀(氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的别离)实验步骤：1.收集菌体：Iml菌液/2人,5k,5，,弃上清。2.加0.5mlBufferA,振荡混匀。3.加50ll0%SDS至终浓度1%,混匀。4.加5lProK至终浓度0.1mgml,55-C保温lh。5.加等体积P
2、CI.混匀,12k.5)6.加等体积氯仿,12k,5,7.加0.8V异丙醇,冰浴30,12k,5。8.70%Eth洗涤沉淀，12k,5。9.枯燥后溶于20lTE,-20C保存考前须知：TriS-饱和酚的使用防止剧烈振荡EP管的使用(酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚-氯仿混合时,蛋白分子之间的水分子就被酚-氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白的密度比水的密度大,因而与水相别离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚-氯仿有机溶剂比重更大,保存在最下层作为外表变性的酚与氯仿,在去除蛋白的作用中各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,
3、大约10-15%的水溶解在酚相中,因而损失了这局部水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好.经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白,此时一起将酚带走)实验二：紫外吸收检11)na的浓度与纯度安画原理：苯环结构AbSorT%光谱扫描定量测定(TU-1901双光束紫外可见分光光度计；DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在26Onm处,吸收低谷在230nm;在26Onm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异.对标准样品
4、来说,浓度为lgml时,DNA钠盐的OD260=0.02,当OD260=1吐dsDNA浓度约为50gml,ssDNA浓度约为33gml,RNA浓度约为40gml,寡核昔酸浓度约为30gml(由于底物不同有差异)；紫外分光光度计只用于测定浓度大于O25gml的核酸溶液)DNA浓度的估算:dsDNA(gml)=50(OD260)倍数ssDNA(gml)=33(OD260)倍数泰山虫草的核基因组DNA紫外吸收扫描图RNA浓度的估算:RNA(gml)=40(D260)X倍数酵母RNA(50gml)的扫描图谱核酸纯度的判断DNA:A260A280=l.8,.8RNA:A260A280=2.0残留酚、蛋白
5、凝胶电泳(假设为DNA样品,A260A280比值大于1.8,说明存在RNA,可以考虑用RNaseA处理;小于1.6,说明样品中存在蛋白质或酚,应再用酚-氯仿抽提,以乙醇沉淀纯化DNA.RNA样品A26O/A28O比值小于2,应考虑再用酚-氯仿抽提)实验步骤：TEbUffel稀释:50x、IoOX旋涡振荡,混匀,离心预热15minCK:400lTE,校零样品测试,A26O、A280实验四：目的DNA片段的回收实验原理：电荷效应分了筛效应硅胶膜吸附凝胶是支持电泳的介质,它具有分子筛效应.核酸是一种两性电解质,在pH8.0-8.3时带负电荷,电泳时向正极移动；而在pH3,5时带正电荷.凝胶Pl收试剂
6、盒提纯DNA片段的原理：主要是通过吸附材料的DNA结合法来到达DNA别离、纯化的目的.吸附材料包括硅基质材料、阴离子交换树脂与磁珠等.其中硅基质材料在高盐低PH(PH7.8)条件下洗脱,可以回收IOobP以上的片段,效率达70%以上。在电场和介质中，不同长度或不同构型的DNA呈现不同的Rf,根据别离片段在凝胶中的位置并参考Marker确定其大小DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动.用电泳法测定DNA分子大小时，应尽量减少电荷效应凝胶回收kit提纯原理:MB打断H键;蛋白解离MW洗去剩余胶液及杂质EB洗脱吸附DNA目的基因的回收包括两个过程:首先是凝胶中的DNA吸附到柱子
7、中的硅胶粒上,主要靠缓冲液调节吸附柱与DNA的pH,来促进DNA吸附到柱子上,离心后将胶液去掉;其次,将吸附到柱子上的DNA重新返溶解到洗脱缓冲液中,再通过离心收集到新的EP管中,到达纯化基因的日的.)膜结合液(溶胶buffer)中的高氯酸钠(NaQo4)又称过氯酸钠,能打断琼脂糖聚合物中糖基间的氢键,使琼脂糖胶块溶解,而且高盐浓度也使与DNA结合的蛋白解离卜来；膜漂洗液(MW)的主要作用是洗去剩余的琼脂糖溶液与杂质,MW除含有缓冲系统外,还有一定浓度的乙醇,用于洗去高盐等杂质,也易使含DNA的硅胶颗粒枯燥；洗脱缓冲液(EB)的作用是使吸附的DNA重新溶解到缓冲液中切胶回收DNA片段电泳图实验
8、步骤：1 .PCR产物的凝胶电泳0.4gAga-40mlTAE,煮沸冷却至55C,2lEtB您倒胶,插梳子,凝固30min加TAE,浸过胶面点样:2l上样液+样品;marke80V电泳,观察;2.切胶与溶胶称EP管,算胶重Img胶加llMBUV302nm下切胶(55C水浴,隔2,摇匀)MB:膜结合液(membranebinding)实际上是一种溶胶缓冲液：3.DNA结合切胶一1.5mlEP管加MB,55C溶胶胶液一吸附柱一收集管120Oog,离心l;4.清洗与洗脱6lMWf吸附柱120Oog,离心30s重复;离心2,力口25lEB12000g,离心1，考前须知2 .平安性:EB,UV2.Aga
9、彻底熔化3.垂直上拔梳子4.忌点样孔穿透5.尽量低电压6.长波切胶7.胶块尽量小8.凝胶全熔实验五：目的DNA片段与载体的连接实验原理：PCR产物3T载体3，实验步骤*5l连接反响体系反响体系PCR回收产物2.0lddI12O1.5lpMD18-T(E5J0.5l对照DNA0.5l2x连接液12.5l2.5l低速离心,16C连接Ih,用于转化(PCR产物与T载体连接前最好进行纯化,以减少引物及其它杂质对连接的影响：纯化方法可以采用PCR产物纯化试剂盒盖紧盖子用手指轻弹EP管或用微量进样器混匀反响液,于台式离心机转2秒钟,以集中样品)实验六：E.co/i感受态细胞的制备与转化实验原理：Ca2+:
10、细胞膨胀,膜磷脂,液晶Ca2+与DNAf羟基-磷酸钙42热激：膜通透性(将处于对数生长期的细菌置入0的CaC12低渗溶液中,使细胞膨胀,同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构,使得位于外膜与内膜间隙中的局部核酸酶离开所在区域,这就构成了.Coli人工诱导的感受态；此时参加DNA,Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶(DNaSe)的羟基-磷酸钙复合物,并粘附在细菌细胞膜的外外表上；经短暂的42C热脉冲处理后,细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,随之出现许多间隙,致使通透性增加,DNA分子便趁机进入细胞内)实验步骤：1.感受态制备：过夜菌,12%种量扩大振荡23h,OD600=0.4,预冷菌液
11、Iml/组,3k,4C离心5,3ml预冷CaC12轻匀离心,0.1mlCaC12悬浮沉淀2.筛选平板的制备：LB固体M熔化,至60加Ap(lOOgml),倒平板,20ml/皿40lX-gal&4lIPTG/皿,涂布放置10min；3.重组质粒转化：5l连接液+50l感受态,轻匀,冰浴30,CK:50l感受态42水浴热激2,冰浴2加450lLB(摇匀),37C,1h离心5,llLB悬浮沉淀转化反响:No转化类型ddH2O受体菌CK+目的片段T-vol1c4.5ml50ml0.5ml055ml2CK-5.0ml50ml0055ml3转化组050ml05ml55ml4.铺平板：55lCK+、CK-、
12、转化组涂布LB固体M(含0.1mgmlAP)平板放置10min37匕倒置,1624h观察结果实验七：碱变性质粒DNA的提取实验原理：细胞裂解质粒别离乙醇沉淀(溶菌酶是糖汁水解前,水解细菌细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的P-1,4糖昔键,因而具有溶菌的作用.当溶液PH小于8时,溶菌酶作用受到抑制；葡萄糖的作用在于增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解;EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌能的反响要求有较低的离子强度的环境)实验步骤：(1)2ml菌液/组,4k,3,100lSol，振荡二室温5-(3)200lSolII,颠倒3次,冰浴5,(4)150lSolIII,同上
13、(5)12k,离心8，,转上清等体积PCI,混匀,12k,又转上清(7)加Vbl3MNaAc(pH5.2),2Volale(8)-2(TC放置3(/,12k,离心10,(9)0.3ml预冷70%Eth洗沉淀，12k,5,(10)枯燥后溶于20lTE,-2(C保存考前须知：摇菌时施加选择压收集菌体时尽最除尽水分加溶液Il5,后,是否变粘稠?SDS质最影响产率（加溶液II5min后,没有看到溶液变粘稠时,实验不能继续做下去.要检查所用试剂是否正确?数量是否符合；对SDS的要求较高,使用重结晶的分析纯SDS,质粒得率较高）实验八：重组质粒的酶切鉴定轰骏原通：8s/HI单切SghHI单切实验步骤：1.
14、酶切反响步骤:ddH2O于EP管fIOxbuffeL质粒DNAf限制酶一混匀,离心5s-37C,50,65C水浴10（1）单酶切反响成分ddH2OIOXKBufTcrDNABamHXTotal需量(l)7.52100.5208mHI(15Ul)组/4人；30,50(2)双酶切反响ECoRl&Pstl（15Ul）绚4人；37,C,50,3 .凝胶电泳检测d0.8%Aga,3OmlTAE,煮沸冷却至55C,2lEtBr倒胶,插梳子,凝固20,2l上样液+样品100V电泳,观察（配制0.8%琼脂糖凝胶（30ml）,加20lEB,酶切样品全部点样,另外取10l未酶切质粒作对照,100V电泳,待澳酚蓝移
15、至胶的3/4位置结束电泳；-HindIIIdigestDNAmarker（50ngl）,由于cos末端之间的结合,会膨响23k和4.36k的条带,因此,电泳前热处理（60C,5min）,使Marker的电泳图像变得更为清晰）酶切失败的可能原因:不全切或根本未切缓冲体系不适宜酶量过多样品杂质含量高DNA被降解:痕量DNase（励切失败主要表现为两方面:（1）不完全防切甚至是DNA根本未发生前切；主要原因有：缓冲体系不适宜,可进行重新酶切；酶量参加过多而导致甘油抑制酶活,可将反响体系适当稀释：DNA样品杂质含量高,可采用稀释酶切或将DNA样品重新抽提后酶切;（2）DNA被降解（不成带状）：主要原因是DNA样品中含有痕量的DNAS,建议重新抽提除去DNA酶）考前须知：吸量要准确最后加酶冰上
