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1、ICS65.020.30CCSB44中国实验动物学会团体标准T/CALASx-201x实验动物小鼠和大鼠成瘾行为实验规范1.aboratoryanimal-StandardOperatingProcedureforAddictiveBehaviorsinRatsandMice（征求意见稿）201 x-xx-xx 发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会发布1刖S本文件按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准附录为规范性附录(或资料性附录)。本标准由中国实验动物学会归口。本标准由全国实验动物标准化技术委员会(
2、SAC/TC281)技术审查。本标准由中国实验动物学会实验动物模型鉴定及评价工作委员会组织。本标准起草单位：中南大学湘雅二医院、宁波市康宁医院、军事医学科学院、北京大学中国药物依赖性研究所、新乡医学院、北京大学药学院、上海精神卫生中心、中科院深圳先进院、广州医科大学附属脑科医院、北京大学基础医学院、华中科技大学。本标准主要起草人：张晓洁、刘惠芬、宋睿、薛言学、赵斌、梁建辉、袁逖飞、朱英杰、范妮、李亦婿、王刚。实验动物小鼠和大鼠成瘾行为实验规范1范围本文件规定了小鼠和大鼠成瘾行为实验设备材料、实验方法和评价指标。本文件适用于从事小鼠和大鼠的成瘾发生发展机制、药物研发等专业机构、教学和科研人员。2
3、规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925-2010实验动物环境及设施GB/Z34792-2017实验动物引种技术规程GB/T34791-2017实验动物质量控制要求GB/T35823-2018实验动物动物实验通用要求GB/T35892-2018实验动物福利伦理审查指南GBT39760-2021实验动物安乐死指南GBT39759-2021实验动物术语GBT39650-2020实验动物小鼠、大鼠品系命名规则GBT39646-2020实验动物健康监测总则T
4、/CALAS75-2019实验动物小鼠和大鼠情绪行为实验规范T/CALAS74-2019实验动物小鼠和大鼠学习记忆行为实验规范3术语和定义以下术语和定义适用于本标准。3.1物质成瘾substanceaddiction物质成瘾是由于反复使用某种物质所引起的一种周期性或慢性中毒状态，其特征表现为不可控制的渴求和觅药行为、突然停药或减量后出现戒断症状、对药物耐受性增加等行为。3.2成瘾物质addictivesubstance成瘾物质是指能够影响机体情绪、行为或意识状态，使机体产生成瘾行为的所有外源性化学物质。3.3戒断症状withdrawalsymptoms戒断症状是在反复使用成瘾物质之后，突然减药
5、、撤药或者阻断药物作用，机体出现一系列生理反应。3.4条件性位置偏爱conditionedplacepreference条件性位置偏爱是实验动物通过将药物的正性强化效应与某个中性环境反复训练建立了关联后，对该环境信息产生偏爱行为的实验。3.5自身给药self-administration自身给药是实验动物通过自主压杆及鼻触等操作获得药物注射的操作式行为实验。3.6行为敏化behavioralsensitization行为敏化是实验动物在反复间断给予成瘾性物质后，对药物反应增加的行为实验。3.7药物辨别drugdiscrimination药物辨别是实验动物通过训练能否区分两种或两种以上的药物的行
6、为实验。4成瘾行为实验方法4.1 戒断实验4.1.1 实验材料4.1.1.1 实验动物a）清洁级或更高等级的成年雄性健康C57小鼠、昆明小鼠、ICR小鼠、SD大鼠、Wistar大鼠等作为建模动物。以下以昆明小鼠和SD大鼠为例进行说明。b）自由饮食，适应环境57天后开始实验。4.1.1.2 实验设备a）戒断实验基本装置包括测试箱、摄像头、视频分析软件。b）测试箱透明，无垫料，便于清楚观察戒断症状、准确采集排尿腹泻等信息。4.1.1.3 实验药品阿片类物质如吗啡、海洛因、可待因等。4.1.2 实验方法4.1.2.1 自然戒断实验a）建模期：给药方式：皮下注射、肌肉注射、腹腔、静脉注射等。以下以盐酸
7、吗啡注射液（IOmg/ml）腹腔注射为例进行说明。给药频次：每天23次。给药剂量：大鼠日剂量从15,30,45到150mgkg递增，或者增加到90mgkg-150mgkg后恒量，持续30天。b）测试期：末次给药1520h后，开始观察自然戒断症状，每天同一时间点观察30min及测量体重变化，连续记录710天。4.1.2.2 催促戒断实验a）建模期：给药方式：皮下注射、肌肉注射、腹腔、静脉注射，灌胃或皮下埋植等。给药频次：每天23次。给药剂量：大鼠日剂量从15,30,45到150mgkg递增，或者增加到90mgkg-150mgkg后恒量，持续15天S小鼠日剂量从30到300mgkg,或者增加到21
8、Omgkg-300mgkg后恒量,持续510天。b）测试期：末次给药6h内，腹腔注射纳洛酮2mgkg-5mgkg催促戒断，立即观察给药后30min内戒断症状和体征。4.1.3 评价指标4.1.3.1 自然戒断实验评价指标小鼠自然戒断后缺乏特征性戒断体征和症状，以体重下降指数作为核心评价指标。大鼠自然戒断症状的表现明显，容易观察。大鼠自然戒断症状评分表如下：将以下九项得分进行相加，算出戒断症状评分总分。a）跳跃、湿狗样抖动、扭体、摇头、打哈欠、扫尾。O分=无；1分=15次；2分=610次：3分10次。b）齿颤、咀嚼（次与次间隔3秒）。O分=无；1分=l10次；2分=ll20次；3分20次。c）流
9、涎：嘴四周湿润为“+”=1分；湿而充盈为“+”=2分；分泌液流出为“+”=3分。d）流泪：眼圈湿润为“+”=1分；湿而充盈为“+”=2分；眼圈周围毛湿为“+”=3分。e）竖毛：以颈部毛发直立为准，有记为1分，无记为O分。f）激惹：触碰动物萎缩不动为O分；有攻击行为但不尖叫为“+”=1分；有尖叫但无攻击行为为“+”=2分；触碰尖叫并伴有攻击行为为“+”=3分。g）眼睑下垂：眼睑闭合Vlomin为“+”=1分;约1020min为“+”=2分;20min以上为“+”=3分。h）腹泻：稀便有形为“+”=1分；稀便不成形为“+”=2分；稀滩便为“+”=3分。i）鼻分泌物：四周湿润为“+=I分：湿而充盈为
10、“+”=2分；分泌液流出为“+”=3分。4.1.3.2 催促戒断实验评价指标a）跳跃和体重下降是小鼠催促戒断症状和体征的核心评价指标，此外，还可以观察到竖尾、扭体、震颤、短暂痉挛、流涎、上睑下垂、腹泻、呼吸频率和深度增加，自发活动明显增多等。b）大鼠催促戒断评价指标和自然戒断相同。4.2 自身给药行为实验4.2.1 实验材料4.2.1.1 实验动物a）采用清洁级或更高清洁等级的成年雄性健康C57/BL小鼠和SD大鼠。b）静脉插管手术时大鼠体重280g320g,小鼠体重20g22g.c）训练期间动物自由饮水，每天限食，实验操作在8：00-18：00之间完成。4.2.1.2 实验装置a）自身给药装
11、置为操作性行为训练箱（20CmXI5cmxl8cm）,放置具备通风功能的隔音箱中。b）自身给药训练箱左侧或右侧墙壁的左上方有照明笼灯，在对面墙壁距离底板4.5Cm的位置有左右2个伸缩压杆或鼻触孔（直径2cm）,在压杆或鼻触孔上面L5cm有信号灯。c）训练箱尺寸和参数可根据实验动物和实验要求进行具体调整。4.2.2 实验方法以下以甲基苯丙胺静脉给药途径为自身给药模型通用的基础技术规范，可根据实验需求及不同成瘾性物质进行相应的剂量和操作的调整。4.2.2.1 自身给药训练将静脉插管术（具体操作见附录）后恢复的实验动物提前Ih放置自身给药装置操作间进行实验环境的预适应。之后将实验动物放置于自身给药训
12、练箱中，进行训练。a）实验程序启动时笼灯亮而有效压杆或鼻触孔上方的信号灯灭。当实验动物踏有效压杆或触有效鼻触孔达到设定次数时，压杆或鼻触孔上方的信号灯亮520s,伴随注射泵的声音实验动物可获得一次药物的注射，之后将有1020s的不应期。当实验动物踏无效压杆或触无效鼻触孔时无任何反应。b）自身给药训练根据不同设定次数程序设置，分为固定比率训练程序（fixedratioschedule,FR）和累进比率程序（PrOgreSSiVeratioSChedule,PR）。c）固定比率训练程序（FR）是指实验动物得到一次药物注射所需要的固定的操作次数。如：FRl,压杆或鼻触1次获得1次药物注射；FR2,即
13、压杆或鼻触2次获得1次药物，以此类推。d）累进比率程序（progressiveratioschedule,PR）是指动物获得一次药物注射所需要进行的操作数不断地增加。每次获得药物的行为成倍数或指数级递增，如1,2,4,6,9,12,15,20,25,32,40,50,62,77,95,118,145,178,219,268,328,402,492,603等。e）在训练的前3天采用固定比率训练程序（fixedratioschedule*FR）使用0.1mg/kg/i.v.的甲基苯丙胺剂量进行FRl初始训练，每个训练时长为34h,注射上限可根据不同的成瘾性物质的毒性设置注射上限。f）初始训练之后换
14、成较低剂量的甲基苯丙胺（0.05mgkg,i.v.）进行FR2训练，训练周期通常为10天，此时实验动物的用药次数后3天的变化率10%,用药行为趋于稳定，可进行下一步实验。g）根据训练时间的长短可分为短时程用药和长时程用药。可根据实验目的需求进行相应的选择。h）短时程训练（shortaccess）,每天每次训练不大于2h,训练周期不多于25天。该训练模式反映了规律性用药特征，每天用药量无显著性的变化。i）长时程训练（extendedaccess或IOngaCCess）,每天每次训练不小于6h,训练周期为1520天；或延长训练周期（ProlOnged或extendedaccess）,每天每次训练3
15、h,训练周期50天以上。该训练模式反映了强迫性用药特征，动物用药行为呈现递增反应。j）当实验动物完成上述固定比例程序训练获得稳定的用药行为后，转换为PR训练，训练时长为6h,记录实验动物获得最后一次药物注射所需要付出的最大劳动力（压杆或鼻触次数），即断点（breakpoint）,断点反映动物为获得药物注射愿意付出的劳动强度的大小，可用于评价实验动物的动机行为和药物奖赏效能。4.2.2.2 消退训练a）当实验动物踏有效压杆或鼻触孔时与压无效压杆或鼻触孔一样，均无任何事件（如信号灯亮，药物注射，注射泵声等）发生。b）每天训练1次，每次34h,实验周期通常为2周，直至出现连续3天的有效鼻触数和无效鼻触数均在10次以内则视作消退成功。4.2.2.3 点燃训练a）药物相关线索点燃：将完成消退的实验动物，放置自身给药训练箱中，当实验动物踏有效压杆或触有效鼻触孔时，将出现用药训练中相同的灯光线索，仍无药物注射，而实验动物踏无效压杆或触无效鼻触孔时，仍无任何事件的发生，在此过程中记录有效反应和无效反应。b）药物点燃：完成消退训练的实验动物，提前
