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1、抗肿瘤药的药效学研究抗肿瘤药的药效学研究抗肿瘤药的药效学研究抗肿瘤药的药效学研究 抗肿瘤药根据其作用原理大致抗肿瘤药根据其作用原理大致可以分为以下几类：可以分为以下几类：细胞毒性药细胞毒性药生物反应调节剂生物反应调节剂分化诱导剂分化诱导剂化学预防药化学预防药逆转肿痛耐药性药物逆转肿痛耐药性药物抗肿瘤侵袭、转移药物的实验方法抗肿瘤侵袭、转移药物的实验方法放疗及化疗增效剂放疗及化疗增效剂1.细胞毒性药的药效学研究细胞毒性药的药效学研究这类药可以通过体外和体内两种方法来这类药可以通过体外和体内两种方法来评价其疗效：评价其疗效：体外常用的方法：、噻唑蓝实验法体外常用的方法：、噻唑蓝实验法(MTT法法)
2、、染料排斥试验、生长曲线、染料排斥试验、生长曲线法、集落形成法、法、集落形成法、SRB法法体内常用的方法：动物移植性肿瘤实体内常用的方法：动物移植性肿瘤实验法验法 MTT法的基本原理：法的基本原理：四氮唑四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide是一种能接受氢原子的染料。活细胞是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲转化成不溶性的蓝紫色的甲月替月替(formazan)，而死的细胞则无此功能。用
3、二甲，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽基亚讽(DMSO)溶解甲溶解甲月替月替后，在一定波长下后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。存活率。操作步骤操作步骤:1选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含酶消化后，用含10小牛血清的小牛血清的RPMI l640培养基配成培养基配成5000个个ml的细胞悬液，接种在的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种孔培养板中，每孔接种200l，37，5CO2 培养培养24h 2.实验组换新的含不同浓度被测样品的培实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，
4、对照组则换含等体积溶剂的培养基，养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设每组设35平行孔，平行孔，37，5CO2 培养培养45 d3弃去上清液，每孔加入弃去上清液，每孔加入200 l新鲜配新鲜配制的含制的含0.2mgml MTT的无血清培养的无血清培养基基37继续培养继续培养4h。小心弃上清，并。小心弃上清，并加入加入200 l DMSO，用微型超声振荡器混，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为匀后，在酶标仪上以试验波长为570nm，参比波长为参比波长为450nm测定光密度值。测定光密度值。结果评定结果评定:按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制
5、率：肿瘤细胞生长抑制率肿瘤细胞生长抑制率(1-OD实验实验/OD对照对照)100 以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度半数杀伤浓度IC50。合成化合物或植物提取纯。合成化合物或植物提取纯品的品的IC5010 gm1或植物粗提物的或植物粗提物的IC5020 gm1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。杀伤作用。染料排斥试验的基本原理：染料排斥试验的基本原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯
6、胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。的细胞比例。生长曲线法的基本原理：生长曲线法的基本原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于
7、代谢产物的积随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。集落形成法的基本原理：集落形成法的基本原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂单个细胞分裂6代或代或6代以上时，其后代代以上时，其后代所组成的群体所组成的群体(集落集落)便含便含50个以上细胞。个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映
8、了单个细胞的增殖潜力，故析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。常用的认为是一种较理想的检测方法。常用的集落形成法可分为集落形成法可分为贴壁法贴壁法及及半固体培养半固体培养法法两种。两种。SRB法的基本原理：法的基本原理：SRB(sulforhodamine B)是一种蛋白质结合是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在大分子中的碱性氨基酸结合。其在515nm波长的波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关读数与细胞数呈良好的线性关系。故
9、可用作细胞数的定量。系。故可用作细胞数的定量。MTT法的一法的一个缺点是个缺点是OD值可随放置时间而变，而值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。模的试验。动物移植性肿瘤实验法动物移植性肿瘤实验法 大多数肿瘤化疗药物都是经过动物移植大多数肿瘤化疗药物都是经过动物移植性肿瘤试验而被发现的，因此动物移植性肿性肿瘤试验而被发现的，因此动物移植性肿瘤实验法是筛选新药中最通用的方法。瘤实验法是筛选新药中最通用的方法。其优点是其优点是肿瘤生长均匀，个体差异小。肿瘤生长均匀，个体差异小。接种成功率高，可达接种成功率高，可达100。对宿主的影响也类
10、似，易于客观判断对宿主的影响也类似，易于客观判断疗效。疗效。动物移植性肿瘤可在同种或同品系动动物移植性肿瘤可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留，以供实验物中连续移植，长期保留，以供实验用。实验周期较短。用。实验周期较短。缺点：缺点：假阳性问题：由于动物瘤株恶性度高，生假阳性问题：由于动物瘤株恶性度高，生长迅速，对药物的敏感性比人类自发的肿长迅速，对药物的敏感性比人类自发的肿瘤高得多，且动物肿瘤的生物学特点与人瘤高得多，且动物肿瘤的生物学特点与人癌有较大的差距，因此对动物肿瘤生长有癌有较大的差距，因此对动物肿瘤生长有抑制作用的药物对人癌不一定有效。抑制作用的药物对人癌不一定有效。假阴性问题：
11、一种药物未必对各种类型的假阴性问题：一种药物未必对各种类型的动物移植性肿瘤都有效，选择某一瘤株供动物移植性肿瘤都有效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药物。筛选都可能漏筛药物。对于假阳性问题，现在对于假阳性问题，现在有用人的实体瘤细胞接种在有用人的实体瘤细胞接种在裸鼠上，进行实验来加以克裸鼠上，进行实验来加以克服。服。几种常用的动物移植性肿瘤几种常用的动物移植性肿瘤小鼠白血病小鼠白血病L1210大鼠大鼠Walker-256瘤瘤Lewis肺癌肺癌 白血病白血病L1210是在是在1948年用甲基胆蒽年用甲基胆蒽DBA/2小鼠诱发所得，它是一种能在小鼠诱发所得，它是一种能在DBA/2小鼠及其杂交一代小鼠
12、及其杂交一代BDF1和和CDF1小鼠上生长的淋巴性白血病，是动物实小鼠上生长的淋巴性白血病，是动物实验治疗中最为常用的一种肿瘤模型，在验治疗中最为常用的一种肿瘤模型，在小鼠白血病小鼠白血病1210的实验治疗中，将的实验治疗中，将1 105个腹水细胞接种在个腹水细胞接种在BDFl或或CDFl小鼠小鼠腹腔内。在接种后腹腔内。在接种后24h开始给药治疗，实开始给药治疗，实验结束后比较对照组与实验组的小鼠平验结束后比较对照组与实验组的小鼠平均存活时间，即可判断药物的疗效。均存活时间，即可判断药物的疗效。Walker256瘤瘤是是1928年在一个怀孕大年在一个怀孕大白鼠的乳腺部位自发产生。接种在皮下或肌
13、白鼠的乳腺部位自发产生。接种在皮下或肌肉内成为实体瘤，接种在腹腔则成为腹水瘤。肉内成为实体瘤，接种在腹腔则成为腹水瘤。在接种后第在接种后第3d开始给药治疗，实验结束后比开始给药治疗，实验结束后比较对照组与实验组的瘤重或大鼠平均存活时较对照组与实验组的瘤重或大鼠平均存活时间，即可判断药物的疗效。间，即可判断药物的疗效。Lewis肺癌肺癌是是1951年在一个年在一个C57BL6小鼠上小鼠上发现的自发性肺内的未分化的上皮样癌。该瘤在发现的自发性肺内的未分化的上皮样癌。该瘤在传代中生长迅速，很快见有出血，并在同系小鼠传代中生长迅速，很快见有出血，并在同系小鼠移植时有很高的成活率移植时有很高的成活率(约
14、约98)。且恶性程度较。且恶性程度较高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性较低，但可高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性较低，但可向肺转移，特别是静脉接种时。可在肺形成瘤集向肺转移，特别是静脉接种时。可在肺形成瘤集落，此模型也可用于抗转移的实验研究在接种后落，此模型也可用于抗转移的实验研究在接种后第第l天开始结药治疗。实验结束后比较对照组与天开始结药治疗。实验结束后比较对照组与实验组的瘤重，即可判断药物的疗效。实验组的瘤重，即可判断药物的疗效。2.生物反应调节剂的药效学评价生物反应调节剂的药效学评价 生物反应调节剂生物反应调节剂(biological response modifiers，BRM)是一类
15、能单独或与化疗是一类能单独或与化疗药物同时应用，有助于提高化疗效果，减药物同时应用，有助于提高化疗效果，减低化疗药毒副反应的药物。这类药物主要低化疗药毒副反应的药物。这类药物主要出自植物和微生物，其作用机理大多是调出自植物和微生物，其作用机理大多是调节机体的免疫功能。节机体的免疫功能。生物反应调节剂动物实验的特点：生物反应调节剂动物实验的特点：生物反应调节剂以口服剂型为主。生物反应调节剂以口服剂型为主。用药时间长。凡经口服给药者，服药期一般用药时间长。凡经口服给药者，服药期一般为为1530d。对实验动物的要求也较高，多推荐使用近交对实验动物的要求也较高，多推荐使用近交系小鼠。系小鼠。本类药物毒
16、性大多较低，本类药物毒性大多较低，LD50常不能求出，常不能求出，选用选用MTD并参考临床用量为给药剂量的依据。并参考临床用量为给药剂量的依据。生物反应调节剂用于体内抗癌试验生物反应调节剂用于体内抗癌试验的方法，与细胞毒类药物基本一致，但的方法，与细胞毒类药物基本一致，但需注意以下几点差异：需注意以下几点差异：给药时间：细胞毒类药物一般在肿瘤接给药时间：细胞毒类药物一般在肿瘤接种后种后24h开始给药，而本类药物开始给药开始给药，而本类药物开始给药的时间和结束时间可以有多种设计，根的时间和结束时间可以有多种设计，根据目的不同较为灵活。据目的不同较为灵活。肿瘤细胞接种量肿瘤细胞接种量：一般比细胞毒类药物：一般比细胞毒类药物低一个数量级，多在低一个数量级，多在11045 个瘤细胞。个瘤细胞。疗程疗程：给药期一般比细胞毒类药物长。：给药期一般比细胞毒类药物长。一些有抑瘤作用的一些有抑瘤作用的BRM类药物，除作类药物，除作肿瘤疗效的筛选外，还需作数项免疫肿瘤疗效的筛选外，还需作数项免疫功能测定指标。功能测定指标。肿瘤是一种分化阻止或分化缺陷病，肿瘤是一种分化阻止或分化缺陷病，采用某种手段克服这种
