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1、RNase T2对精子运动作用的信号通路研究 The signaling pathway for effects of RNase T2 on sperm motility 精子运动不良是导致男性不育的最常见因素，因此以弱精症的研究为突破口，寻找导致精子运动功能下调的关键分子，已成为生殖医学和生殖生物学目前研究的热点。前期研究中我们发现RNase T2在人精子和精浆中表达。背景1.黑曲霉菌培养液中RNase T2蛋白纯化及鉴定实验内容 2.人RNASET2重组蛋白的真核表达、纯化及鉴定3.核糖核酸酶T2对人精子运动力作用的检测4.人精浆及精子中RNASET2蛋白检测5.人精子中RNASET2相
2、互作用蛋白的鉴定及验证研究成果1.通过培养黑曲霉菌得到其培养液，并且通过离子交换层析和非变性聚丙烯酰胺电泳等方法成功的分离纯化出具有生物活性的核糖核酸酶T2蛋白。并通过蛋白质谱分析及Western Blot得以证实。图1 RNase T2蛋白纯化过程的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果。A：Mono Q 层析后蛋白电泳图；B：MD-TMAE层析后蛋白电泳图；C：目的蛋白回收后蛋白电泳图。（Marker：蛋白分子量标准；RNaseT2：黑曲霉菌培养液中分离纯化的RNase T2蛋白）图4 纯化的RNaseT2蛋白分析。A：蛋白电泳及银染结果，显示35 kD大小的特异蛋白条带。B：免疫印迹实验以R
3、NASET2抗体可以识别该纯化的RNaseT2蛋白（箭头指示）。研究成果2.通过构建RNASET2全长基因质粒，并在真核细胞HEK-293E细胞中表达纯化了RNASET2重组蛋白。经免疫印迹和蛋白质谱分析确认该蛋白为人RNASET2。图6 真核表达的rRNASET2蛋白分析。A：纯化蛋白的SDS-PAGE结果。B：免疫印迹鉴定rRNASET2蛋白，Lane 1为纯化的rRNASET2蛋白，Lane 2为人精浆蛋白（阳性对照）。研究成果3.运用计算机辅助精液分析仪检测发现，核糖核酸酶T2在不同时间节点均对正常生育男性精子的活动力、前向运动有显著地抑制作用，且该抑制作用呈现时间依赖性。下图展示了在
4、4个时间点，实验组与空白组、实验组与对照组的精子活动力与前向运动力都有显著的统计学差异。图：RNaseT2对人精子活动力的作用。A：RNaseT2对人精子活动力的作用，显示与RNaseT2孵育1 h后，精子运动力显著下降。B：RNaseT2对人精子前向运动的作用，显示与RNaseT2孵育30 min后，精子前向运动力显著下降。（*P 0.05，*P 0.01）4.经双抗夹心法ELISA检测精浆RNASET2蛋白含量，我们弱精子症患者精浆中RNASET2蛋白含量明显高于正常组。免疫印迹同样验证了这一结果。研究成果图：正常精浆和弱精子症精浆中RNASET2蛋白含量比较。A：ELISA结果，*P 0
5、.01；B：免疫印迹结果。在弱精子症精子中RNASET2含量也显著增加，尤其是在精子的颈部和尾部中段。侧面证实RNASET2蛋白可以抑制精子运动，而精液中RNASET2蛋白异常高表达可能是部分弱精子症发病的原因之一。图10 免疫荧光染色比较正常精子和弱精子症精子中RNASET2蛋白含量。A=弱精子症精子，N=正常精子。研究成果流式分析同样也表明RNaseT2在弱精症患者精子中表达高于正常男性精子。RNaseT2或可以作为弱精症男性精子的分子标记，用于临床检测弱精症。N组：61 例；A组:77例研究成果研究成果5.蛋白免疫共沉淀实验比较成功。而蛋白质谱结果中，我们发现有actin蛋白、AKAP4
6、。而我们所在课题组也在前期研究中证实人精子中RNASET2可以与actin蛋白结合。图11 人精子中RNASET2与actin蛋白免疫荧光共定位图。研究成果后期通过免疫印迹和免疫荧光共定位检测，我们又验证了人精子中RNASET2与AKAP4存在相互作用因此，我们推测：RNASET2可能通过与精子尾部的AKAP4蛋白作用，影响精子PKA信号通路，进而阻碍精子运动。图12 人精子中RNASET2与AKAP4蛋白相互作用的检测。A：免疫印迹检测RNASET2蛋白免疫共沉淀结果含有AKAP4蛋白；同样AKAP4蛋白免疫共沉淀结果含有RNASET2蛋白。B：AKAP4与RNASET2在人精子尾部存在共定位。研究成果6.已完成两篇名为精子变形中机制的研究进展与哺乳动物胚胎植入分子机制的研究进展的综述文章分别阐明近五年来对于精子变形相关和哺乳动物胚胎植入领域的最新研究成果。实验中曾存在的问题以及解决思路1男性精液样本珍贵、采集周期较长、经费较少。2初始阶段获取的RNaseT2蛋白纯度较低。探索出透析、蛋白亲和层析、阴离子交换层析、分子筛过滤层析以及Native-PAGE电泳分离，超滤分离相结合的方法，纯度达到90%以上。3菌液蛋白获取困难，黑曲霉菌菌种纯度直接影响后期蛋白获取的纯度。因此要避免培养时杂菌污染。
