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1、临床分子诊断实验室的风险点与风险评估近年来，风险管理的理念在医学实验室管理中日益受到广泛重视。风险管理指如何在一个肯定有风险的环境里把风险减至最低的管理过程。风险管理方法是基于对风险的认识、衡量和分析，选择最有效的方式，主动地、有目的、有计划地处理风险，以最小成本争取获得最大安全保证的管理方法。对于医学实验室的风险管理，指当检验结果影响患者安全时，实验室应评估工作过程和可能存在的问题对检验结果的影响，应修改过程以降低或消除识别出的风险，并将做出的决定和采取的措施文件化。实验室风险评估包括实验室风险估计和风险评价两个过程。风险估计是将危害发生概率与严重程度赋值的过程，接下来进行风险评价，估计风险
2、与给定标准的比较，确定风险的可接受性。总结起来，即判断实验室有哪些风险点，然后判断风险点发生的概率与它的严重程度，进而评价可接受性。其目的是与实验室预定风险进行比较，把风险设定在可接受或可控的范围。在临床实践中有学者认为实验室风险评估仅仅是生物安全管理，实际上实验室风险管理是基于实验室生物安全，加入检测项目风险和设备医疗安全等，最大程度保证检测人员和病人的安全。实验室风险管理相关规范、标准有风险管理原则及指南IS027001和IS031000。关于生产商风险管理的标准有医疗设备风险管理IS014971、识别和控制实验室误差来源的风险管理技术（FMEA、FTAxFRACAS）、CLSIEP18和
3、CLSlEP23o基于风险管理的实验室质量控制规范可以学习ISO22367o医学实验室可通过风险管理和持续改进减少错误，本文以分子实验室为例，介绍了实验室风险管理的实施过程。1、标本采集的风险评估临床实验室的风险评估涉及检验前、中、后的风险评估。1.标本采集运输保存：(1)检验前。方法选择和标本类型关乎结果，对于新冠核酸检测可以做普通的荧光定量PCR、测序或等温扩增。标本采集、运送和保存是质量保证的关键性环节，在采集点是否需要放置冰箱、在常温放置多久等问题都直接关系到检验质量，可通过验证放置时间、提取效率是否降低来保证质量。实验结果的不准确60%以上来源于检验前，涉及方法选择、标本类型选择、标
4、本的采集、运送和保存。(2)检验中。以新冠核酸检测为例，北京定期都会有监督管理部门如北京市疾控中心、区疾控中心还有每个区的质量监督部门组织的检查。实验室环境的分区需要做好温湿度控制，物品专用、设备专用和试剂专用。设备需要维护、定期校准。试剂要做好性能验证或性能确认。做好人员培训、室内质控和室间质评。对于新冠核酸检测来说，特别需要做好人员之间的比对，因为基于人工操作的步骤比较多。(3)检验后。需要对数据分析、结果解读、对临床应用(筛查、诊断、预测、治疗)的指导和评估与临床的诊断符合率。对于新冠核酸检测来说，由于是定性项目相对比较简单，对于定量的项目则需要判读截断点以及临床诊疗符合率有多少。2.分
5、子检测标本采集原则：(1)样本的留取量和类型：CNAS-CL02:2012:5A4.2采集前活动的指导(c)原始样品采集的类型和量，这部分有详细规定。对新冠核酸检测来说可以采用鼻拭子、咽拭子和肛拭子，规范地采集咽拭子，其后续核酸提取效率并不亚于鼻拭子。采集量和采集类型应当熟记。(2)样本不被外界因素污染：CNAS-CL02:5.4.43:使用无DNase和/或无RNaSe的一次性密封容器。其中强调了密闭，不应在外界环境中打开。(3)适当处理满足检验要求：CNAS-CL02:5.4.4.3(b)正确使用抗凝管；(C)用于RNA扩增检测的血样宜进行抗凝处理；(d)分泌物、拭子、肿瘤组织等样品留取注
6、意事项，这部分有明确规定。(4)保护操作者不被潜在病原体感染：CNAS-CL05:实验室生物安全认可准则，第二部分第九条介绍了采集病原微生物样本应当具备的条件。3.分子检测的标本转运：(1)针对不同基质的标本和检测目的做出适当处理：CNAS-CL02:5.4.7指出，样品应尽快处置并以适当方式存储，检验样本若为组织，固定液的量和固定时间应符合检测要求。(2)标本妥善处理后及时送检：CNAS-CL02:2012:5.4.5(a)要求，运送时间适合于申请检验的性质和实验室专业特点。基于文件要求样本在室温下放置不能超过4小时。(3)送检过程环境需要符合要求：CNAS-CL02:2012:5.4.5(
7、b)规定，保证收集、处理样品所需温度范围，使用指定保存剂，以保证样品的完整性。在夏天需要放置冰袋保证标本环境温度，冬天的华北地区保证三层包装、保证运输的完整性。(4)超时存储标本需要重新评估标本完整性：CNAS-CL02:5.4.7规定，超长储存后的标本，使用前应再次评估样本的完整性。因需要半个小时运送到实验室，所以至少每三个半小时运输一次。(5)转运过程不会污染环境：CNAS-CL02:2012:5.4.5(C)规定，确保运送者、公众及接受实验室安全，并符合规定要求。运输箱里配备消毒的器具，防备意外的遗洒。4.标本转运及质量要求：DNA检测全血、血清和血浆标本可室温稳定24h,28。C可稳定
8、72h0RNA检测应加入RNA稳定剂，转运须在28进行。DNA在TriS-EDTA中更稳定，室温可保存半年，2-8C1年，-20。C7年，-7(HZ7年。保存的产物应当标记清楚。分子检测血清、血浆标本长期储存需分离转移至无RNaSe酶的密封容器中。分子检测血液标本不宜反复冻融，反复冻融会严重影响样本中核酸片段的完整性，多次冻融应该评估标本完整性。还需要指出，分子检测血液标本不能放置在自动除霜功能的冰箱中。2、分子诊断实验室的风险评估1 .分子实验室环境设置：环境设施基本要求：(1)应合理分区，工作有序。CNAS-CL02:5.2.2规定，涉及基因扩增检验的实验室原则上至少3个独立的工作区域，具
9、体实验室分区应依据其所使用的技术平台及检验项目和工作量而定，例如处置区与工作区分开。(2)环境条件符合要求。CNAS-CL02:5.2.2规定，实验室及相关办公设施应提供与开展工作相适应的环境。应依据所用设备和实验过程的要求，制定环境温湿度控制要求并记录。(3)防止各区域相互污染，互不干扰。CNAS-CL02:5.2.6规定，不同实验区域应该有其各自的清洁用具以防止交叉污染，进入基因扩增实验室应按单一方向进行。2 .分子诊断实验室主要设计依据：(1)依据关于印发医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法的通知(卫办医政发(2010)194号)及其附件医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则有关规定，
10、北京地区开展分子检测需经北京市医学检验质量控制与改进中心审核。国内其他地区也根据这些规定指导分子生物学检测实验室的设计与建设。(2)相关规范和标准有：GB50346生物安全实验室建筑技术规范、GB19489实验室生物安全通用要求，特别建议要重视WS/T233-2018病原微生物实验室生物安全通用准则。WS/T442-2014临床实验室生物安全指南中，对生物安全实验室做了清晰而明确的规定。检验科工作人员要意识到，只要进到检验科，就是进到了一个相对不安全的区域，就需要告知其风险，临床实验室应参照二级生物安全实验室实现分区及分流。医疗卫生机构检验实验室建筑技术导则中也有相应的规定。3 .分子诊断实验
11、室设备和试剂及材料:(1)分子诊断实验室各分区应合理安排设备。CNAS-CL02:5.3.1.1规定，实验室应配备其提供服务所需的全部设备，例如各种冰箱、离心机。(2)仪器、试剂和材料必须符合国家规定和相关行业标准。(3)设备必须定期进行校准和维护。CNAS-CL02-A001:5.3.1.4规定，应定期对加样枪、生物安全柜、扩增仪等进行校准。需要确认实验室校准的内容、标准，复核后签字。5.3.1.5指出，设备故障修复后，可通过一些合适的方式进行检测、验证。(4)根据需要选择枪头量程及是否带滤芯，根据PCR仪选择不同的八连管，RNA检测应用DEPC水，并定期检测是否合格。避免实验室出现假阳性。
12、4 .分子诊断实验室布局：传统PCR实验室分为四个区：试剂准备区、样本制备区、核酸扩增区和产物分析区。在新冠核酸检测中至少需要试剂准备区、样本制备区和扩增分析区。PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。样本制备间(BSL-2)要适当增大，便于处理较多的样本量。当采用新风系统有困难时，每区的空气只能在其室内自循环。如果没有新风系统，要保证充分的通风。5 .分子诊断实验室环境设施要求：各区域入口应有明确的标识，不同区域物品不能混用。各区域应配备足够的温度适宜的存储空间，并进行温度监控和记录。各区域根据设备及实验要求设定符合要求的温度和湿度。各区域备有消毒物品，装备紫外线灯、水池、电话、网线以及做
13、好应急预案。标本处理区放置洗眼器、高压锅等。6 .分子诊断实验室设计细节问题：房间大小要根据设备数量和工作确定，一般要求试剂储存区最小，样本处理区最大。消毒设备方面，实验室内应配置内排式压力蒸汽灭菌锅，以及其他适用的消毒设备。设备摆放原则是避免相互干扰，避免气溶胶污染。桌柜和设备之间应有足够的间距，以便于清洁。标本制备区设立紧急洗眼器。实验室走廊宜设置喷淋装置。7 .分子诊断实验室设备要求：PCR仪应该带有UPS电源。另外RNA检测必须配备低温离心机和超低温冰箱。这是实验室设计时需要注意的，应预留出这些设备的摆放空间。如表1。表1.分子实验室设备要求试剂准备区标本处理区扩增区分析区PCRti.
14、必备核酸分析系统必备生物安全柜龌必备离心机必备必智加热恒温器选配冰箱必备必备7选配震荡混匀器必备必备加样枪必备必备选配紫外灯必备必备必备选配办公用品选配选配选配选配注(1)PCR仪和分析仪应该带有UPS电源；(2)RNA检熏必须配备低温离心机和超低温冰箱3、分子实验室的性能验证分子实验室性能验证有相应的法规，即CNAS-GL039:分子诊断检验程序性能验证指南。1 .性能验证的时机：CNAS-GL039:4.1对于性能验证的时机作了规定。CNAS-CL02:5.3.1.4指出，应进行外部校准的设备，如果符合检测目的和要求，可按制造商校准程序进行。5.3.1.5指出，设备维护与维修可能影响方法学
15、性能，故障修复后可通过合适的方式进行相关的检测、验证。5.3.2.3规定实验室应对新批号或同一批号的试剂和关键耗材进行验收。性能验证时机包括：(1)检验程序常规应用前；(2)任何严重影响检测系统分析性能的情况发生后，包括仪器主要部件故障，仪器搬迁，设施、环境严重失控等；(3)检测系统包含的任一要素(仪器、试剂、校准品等)变更，如试剂升级、仪器更新、校准品溯源性改变都需要按照新系统进行验证。2 .性能验证的参数：CNAS-GL039:4.2对此做了说明，对于PCR定性和定量检测、二代测序(NGS)等项目的性能验证参数分别做了规定。PCR定量检测项目需要验证包括测量正确度、测量精密度(重复性和中间精密度)、测量不确定度、线性范围等；PCR定性检测项目需要验证包括符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等；NGS选择性能验证的指标包括符合率、检出限等。需要注意的是，如果样本类型包括血清和血浆，应进行血清和和血浆一致性的验证。检验程序高度依赖人工操作或判断，应进行不同人员间的比对。3 .性能睑证判断标准:CNAS-GL039:4.3对于性能验证的判断标准做了详细规定。实施性能验证过程需要注意以下几点：（1）熟悉操作系统；（2）室内质控在控；（3）实验方案设计要综合考虑标本选择（标本类型、标本数量、浓度、不同基因型
