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1、临床不孕症相关的自身抗体检测及应用随着人们生存环境和生活方式的改变，不孕不育已成为临床常见的疾病之一，自20世纪80年代以来发病率增加了4%,我国约有10%15%的已婚夫妇患有不孕不育1o其病因非常复杂，主要包括生殖系统器质性病变、性激素分泌紊乱、免疫学异常等，其中输卵管和卵巢等生殖系统器官组织病变是不孕不育的重要致病因素。对于此类病因，临床可通过影像学及宫腔镜等方式确诊并治疗，然而免疫学因素在不孕不育诊治及监测上的作用往往被忽视。近年来随着生殖免疫技术的不断发展，多种生殖免疫相关抗体被发现，这些抗体对于临床不孕不育的诊断和治疗有着至关重要的作用。首先，受精过程极其复杂，精子射入阴道后进入输卵
2、管腔，精子顶体表面糖蛋白被生殖道分泌物中的Q、B淀粉酶降解，同时顶体膜中的胆固醇与磷脂比率及膜电位发生变化，降低顶体膜的稳定性，使精子获能；获能的精子运行到输卵管壶腹部与卵子相遇，精子释放顶体酶，溶解卵子外围的放射冠和透明带，穿过透明带的精子外膜与卵子胞膜接触并融合，使精子进入卵子内，形成受精卵。受精卵不断进行细胞分裂，同时借助输卵管蠕动和输卵管上皮纤毛推动向宫腔方向移动，并逐渐埋入子宫内膜，发育成正常的胎儿。我们将从卵子发育、受精和着床方面阐述不孕症相关抗体。一、卵子发育阶段卵巢为女性的性腺，其主要功能为产生卵子和分泌女性激素，同时具备生殖功能和内分泌功能。在卵巢中，卵泡自胚胎形成后即进入自
3、主发育和闭锁的轨道，进入青春期后，卵泡由自主发育至发育成熟的过程依赖于促性腺激素，此过程中产生抗体，如抗卵巢抗体、抗绒毛膜促性腺激素抗体等均会影响卵子的形成与发育，从根本上导致不孕症。(一)抗卵巢抗体(anti-ovarianantibodies,AoAb)卵巢具有生殖和内分泌功能，同时受到神经-内分泌系统的调节及免疫系统的影响。机体免疫功能异常可诱发卵巢自身免疫反应，产生抗卵巢抗体，使卵泡发育障碍，从而引起不孕不育。Kadi。官Iu等2通过对62例体外受精的不孕症患者的研究发现，体外受精患者血清AoAb水平明显高于正常生育对照组，表明AoAb与体外受精失败患者的不孕症有关。另外，Kosir和
4、PogaEnik3的研究表明抗卵巢抗体的存在与细胞免疫异常等自身免疫机制可能是原发性卵巢功能不全的病因。最后，有研究表明，采用人源卵巢抗原，以胶体金颗粒结合的羊抗人IgG为标记抗体，根据免疫胶体金技术原理，建立免疫胶体金渗透技术法检测AoAbo通过分别检测72份AoAb阳性血清和88份健康体检女性血清，并与酶联免疫吸附试验(Enzyme-1inkedimmunosorbentassay,E1.ISA)的结果进行对比分析，结果显示与E1.1.SA的结果对比，其敏感度为86.11%,特异度为90.91%,免疫胶体金渗透技术测定AOAb具有稳定性和特异性4o由此可见免疫胶体金渗透技术可以快速准确地测
5、定AoAb,便于推广普及。(二)抗绒毛膜促性腺激素抗体(anti-humanchorionicgonadotrophinantibody,AhCGAb)人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotrophin,hCG)是一种由合体细胞滋养层分泌的糖蛋白激素，含有92个氨基酸的亚基和145个氨基酸的B亚基。B亚基具有特异性，并有一组类似于转化生长因子B的序列。这种相似性表明hCG与某些癌症的发生和母体子宫内膜的滋养细胞侵袭有关5ohCG作为免疫调节剂，通过蜕膜化子宫内膜基质细胞、滋养层细胞侵袭、子宫自然杀伤细胞增殖、刺激子宫内膜血管生成和黄体维持孕酮分泌来促进着床6,对于卵子发
6、育必不可少。一项包括200例人工授精妇女的前瞻性研究表明，应用hCG的实验组临床妊娠率(26%)明显高于对照组(9%,P=O.002),试验组持续妊娠率(23%)明显高于对照组(7%,P=O.003),但两组流产率差异无统计学意义，表明hCG在妊娠过程中起着至关重要的作用7。但是，关于近些年AhCGAb的高质量研究较少，仍需大量机制相关研究证实。最后，尿中hCG的检测除E1.1.SA8、免疫萃取-串联质谱法9夕卜，Ahi等10利用毛细管驱动的微流控芯片，建立了一种基于表面增强拉曼散射信号的抗体修饰的磁性金属有机骨架纳米颗粒夹心免疫分析方法检测尿液中的hCG,不仅能够最大限度地减少试剂和样品体积
7、,而且整个过程大约在1h内完成，与传统的液相色谱-质谱法(Iiquidchromatography-massspectrometry,1.C-MS)、E1.ISA免疫印迹法(westernb1.otting)等检测hCG的方法相比，不需要耗时和复杂的预处理步骤，具有较短的检测时间，且结果真实可靠。二、受精卵形成获能的精子与次级卵母细胞相遇于输卵管，结合形成受精卵的过程称为受精，受精多数在排卵后数小时内发生，一般不超过24h,对于不孕症女性来说，精子为异己成分，结合过程中可以产生抗精子抗体、抗透明带抗体等影响精子与卵子结合，从而影响受精卵的形成。(一)抗精子抗体(anti-SPerEantibo
8、dies,AsAb)抗精子抗体是引起不孕的常见原因之一，由于精子具有抗原性，其对于女性来说是异己成分。正常情况下，女性生殖道具有屏障作用，并且阴道和子宫内膜有对抗原物质的清除，避免了抗体的产生。目前提出的可导致女性抗精子免疫的机制包括：(1)在女性生殖道中的免疫活性细胞吞噬精子并随后将精子抗原呈递给免疫系统之后，发生免疫反应；(2)女性宫颈手术，宫颈慢性创伤，生殖道感染等也可刺激机体产生抗精子抗体；(3)某些过敏体质的女性，对射入生殖道内的精液可产生过敏反应，当精子在女性生殖道内降解受阻时会进入腹腔，从而刺激机体产生抗精子抗体11o抗精子抗体可与精子结合使精子穿透能力下降，无法穿透宫颈黏液，也
9、可抑制精子释放透明质酸酶，从而抑制顶体反应，导致女性不孕。HUO等12对天津地区的1711例女性不孕症患者和1305例男性不育症患者的AsAb进行了比较，表明不孕不育患者血清ASAb水平高于健康对照组，男女人群中抗体水平差异均有统计学意义(P0.05)o庞晓霞13以82例女性不孕症患者为研究对象，发现原发性不孕患者的ASAb阳性率最高，与复发性流产患者(18.29%)和继发性患者(18.29%)相比差异有统计学意义(P0.05)o最后，AsAb有多种检测方法，包括免疫胶体金技术、间接免疫荧光、浅盘凝集试验、精子制动试验等，而Gatime1.等14的研究表明，若在常规精子检查中发现精子凝集，或者
10、有阴囊外伤或腹股沟手术史，应将混合抗球蛋白反应(mixedantig1.obu1.inreaction,MAR)试验检测ASAb作为调查生育状况和辅助生育技术前的系统检查。但是，这项研究是使用SPerMar测试进行的，使用免疫珠测试获得的结果可能不具有可比性。(二)抗透明带抗体(anti-zonape1.Iucidaantibodies,AZPAb)透明带(zonape1.Iucida,ZP)是卵母细胞及颗粒细胞分泌的，由4种糖蛋白组成的细胞外基质，在初级卵泡期的卵母细胞周围形成，并且在卵泡/卵母细胞生长期间厚度增加。排卵后，ZP作为精子屏障以及精子顶体诱导和胚胎保护。ZP具有很强的免疫性，能
11、有诱发自身免疫反应，产生AZPAb。AZPAb所致不孕可能是多方面的：（1）和透明带抗体有交叉抗原性或者其他致病因子使得透明带抗体变异，产生损伤性透明带免疫，导致不孕；（2）抗透明带抗体可抵抗精子顶体酶的消化作用，使精子与卵子无法结合，从而导致不孕；（3）抗透明带抗体与抗原结合，阻止精子通过透明带，导致不孕15oWang等16的研究结果表明，ZP3是精子在卵细胞上的主要受体，是顶体反应的诱导者，在受精过程中起着关键作用。抗ZP3抗体可引起卵巢的病理改变，导致卵巢功能障碍，引起不孕症。近年来研究表明，在常规体外受精患者中，AZPAb滴度越高，受精率越低，并且在不明原因的不孕症患者的血清中，AZP
12、Ab的检出率高达46.9%17。最后，检测AZPAb的方法有免疫沉淀反应、间接免疫荧光法、间接血凝、胶乳凝集试验、R1.A及E1.1.SA法等（以E1.ISA法最常用）。无论何种检测方法，均需有透明带抗原，由于猪和人卵透明带有共同的抗原成分，故常选用猪卵的透明带抗原进行AZPAb的检测。三、受精卵着床晚期囊胚种植于子宫内膜的过程称为受精卵着床，受精卵着床经过定位、黏附和侵入3个过程，必须具备透明带消失、囊胚细胞滋养细胞分化出合体滋养细胞、囊胚和子宫内膜同步发育且功能协调、体内分泌足量的雌激素和孕酮等条件，在此过程中产生抗子宫内膜抗体、抗磷脂抗体等均会影响子宫内膜容受性，导致不孕症。(一)抗子宫
13、内膜抗体(anti-endometriumantibodies,AEmAb)正常情况下，子宫内膜对机体无抗原性，但是在子宫内膜异位症的患者中，异位的子宫内膜可作为抗原刺激机体产生特异性的AEmAb。AEmAb可与子宫内膜腺上皮细胞中的孕激素依赖结合蛋白结合后发生免疫反应，损害子宫内膜，干扰受精卵着床及胚胎发育，从而导致不孕18oBarnhart等19通过对22项研究的1项荟萃分析表明，子宫内膜异位症患者的受精和着床率降低，卵母细胞数量显著减少，并且重度子宫内膜异位症女性的妊娠率低于轻度子宫内膜异位症女性(0R=0.60,95%CI:0.420.87)oHUO等12研究表明原发性不孕症和继发性不
14、孕症女性的血清AEn1.Ab阳性率均高于健康对照组，但原发性不孕症和继发性不孕症患者中AEmAb水平对于诊断不孕症等方面的意义仍需进一步探讨。最后，AemAb的检测方法有多种，许国强等20通过对比斑点金免疫渗滤法与常规E1.1.SA法检测AemAb的研究表明，在586份血清的检测中，斑点金免疫渗滤法阳性率为36.8%（216/586）,与E1.1.SA法（206/586）的结果基本一致，其敏感度为95.6%,特异度为94.7%,可见斑点金免疫渗滤法具有良好的特异性。（二）抗磷脂抗体（anti-phosphoIipidAntibodie,aP1.）抗磷脂综合征（antiphosphoIipids
15、yndrome,APS）是一种自身免疫性疾病，其特征是反复出现动脉和/或静脉血栓,病态妊娠及存在持续高滴度aP1.阳性。其临床发病率高，发病机制涉及aP1.所诱导的细胞活化、抑制抗凝和纤溶系统、炎症反应、补体激活及氧化应激等许多方面。APS临床表现复杂多样，可累及全身多个器官和系统。2019年抗磷脂抗体检测的临床应用专家共识21指出，尽管分类标准中要求aP1.持续高滴度阳性，但是低滴度aP1.阳性与病理妊娠可能相关。一项纳入2053例因不孕症接受体外受精的妇女的研究表明，703名（34%）不孕症患者aP1.（抗心磷脂或抗B2糖蛋白I抗体）水平升高，但未发现aP1.与体外受精结局存在相关性22o
16、PaU1.myer-1.aCrOiX等23的研究发现，与有生育能力的妇女相比，需要体外受精的不孕症妇女中，抗磷脂抗体水平升高约20%,主要是抗B2-GP1抗体。最后，有研究通过对2种不同方法检测aP1.的分析表明，对于APS患者抗心磷脂抗体和抗B2糖蛋白I抗体检测，化学发光法整体阳性率均高于E1.1.SA法，可以弥补E1.1.SA法对APS患者的漏检，且时间较短，可自动化操作，更适合应用于临床检测24o本团队曾经针对血清aP1.水平与不孕症的关系开展研究，结果显示与正常妊娠女性相比，不孕症患者的狼疮抗凝物的阳性率较高，文章即将发表。（三）其他抗体近些年来，有研究表明，抗甲状腺抗体与不孕症之间有关，在接受体外受精和胚胎移植的不孕症患者中，携带抗甲状腺抗体的女性受精率、植入率和妊娠率明显低于未携带这些抗体的女性25o但Chai等26的研究表明患有自身免疫性甲状腺炎和/或亚临床甲
