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1、凝血因子VIII活性检测现状及发展趋势所有存在于血浆的凝血因子中，凝血因子ViI1.(coagu1.ationfactorVIII,FVIII)含量最低(约为0.1mg1.),却发挥着重要的止凝血功能。FVI1.1.实验室检测主要分为活性(FVIII：C)检测和抗原(FVIII：Ag)检测两部分。目前，国内实验室多采用一期法进行FVII1.：C检测来评估FVI1.1.功能。FVII1.：C降低多见于血友病A(hemophi1.iaA,HA)、获得性血友病A(acquiredhemophiIiaA,AHA)和血管性血友病(vonWiI1.ebranddisease,VWD)等，其中FVIII：C
2、在HA等疾病的诊断、分型、疗效监测和抑制物滴度检测等各方面中起着至关重要的作用。因此，准确而快速的FVIII:C检测对患者和临床医生而言意义重大1,2,3,4,5,6o然而由于检测系统多样化、试剂组分的差异及干扰物质的存在等影响因素，国内各实验室间的检测结果可能存在差异，进而影响患者的诊断及治疗。一、FV1.1.1.的结构与功能FVI1.1.基因的总长度为186000bp,有26个外显子，位于X染色体长臂(Xq28)o与大多凝血因子不同的是，除了肝脏合成外，FVI1.1.还可以在血管内皮细胞合成。FVII1.是一种由2332个氨基酸残基组成的辅酶，其结构与凝血因子V和铜蓝蛋白相似，即由3个A区
3、(A1、A2和A3),一个中心B区和两个C区(C1.和C2)共6个结构域组成，自氨基末端起分别是A1-A2-B-A3-C1-C20FVW以一条N端重链(A1-A2-B)和一条C端轻链(A3-C1-C2)组成的异二聚体形式存在。重链和轻链间通过金属离子在A1.区和A3区以非共价结合方式连接。C2区以非共价化合物形式紧密结合血管性血友病因子(vonWi1.1.ebrandfactor,vWF),进而抑制FVII1.与磷脂间的相互作用。经过凝血酶裂解后，FV1.1.1.发生活化。活化的FVII1.(activatedcoaguIationfactorVIII,FVIIIa)从VWF上解离，变为由A1
4、.区、A2区和A3-C1-C2三部分构成的异三聚体。在钙离子(Ca2+)存在的条件下，FV1.i1.a与活化的凝血因子IX(activatedcoaguIationfactorIX,FIXa)在磷脂(phosphoIipid,P1.)表面形成TenaSe复合物(FIXa-FVIIIa-Ca2+-P1.),进而大大提高其激活凝血因子XCcoagu1.ationfactorX,FX)的速率7,8,9o当A2区从A1.区与A3-C1-C2上解离后，FVIiIa失活。除此之外，活化的蛋白C也可通过作用于特定的精氨酸残基的方式使FVIIIa失活1。而VWF的存在可将FVI1.1.的半衰期由2min延长至
5、约812h10,11,12o二、FV1.1.1.与出血性疾病(一)HAHA是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病3,13,14,15,16,17,实验室检查结果为活化部分凝血活酶时间(activatedpartiaIthrombopIastintime,APTT）单独延长,FVIII:C降低和VWF抗原（VWFantigen,VWF:Ag）正常等。HA发病率没有种族或地区差异。由于其遗传特性，HA在男性人群中发病率较高（约为1/50002,9）,而女性HA患者较为罕见。HA患者出血严重程度与FVIII:C相关1,13,根据FVIII:C结果将HA分为轻型、中间型和重型：（1）轻型：FVIII
6、:C在5%40%之间，自发性出血较为少见；（2）中间型：FVIII:C在1%5%之间，偶有自发性出血；（3）重型：FVIII:C1%,常发生自发性出血2,3,6,18o但FVIII:C结果相同的患者亦可有不同的临床出血表现15,19oHA治疗方案主要分为按需治疗2与预防治疗20,21；而当发生最严重的并发症时，产生FVII1.抑制物2,7,22,23,24,25,26,治疗方案需要调整为控制出血与抑制物清除治疗两部分27,28o（二）AHAAHA是以循环血中出现抗FVI1.1.的自身抗体为特征的一种自身免疫性疾病，实验室检查结果为APTT单独延长，FVIII:C降低，vWF:Ag正常和FVi1
7、.1.抑制物检测阳性等7,22,23,24,26,29,30,31。在我国，AHA年发病率约为1.5/100000,多发生于自身免疫性疾病患者和围产期女性，约半数患者无明显诱因。除围产期女性发病率高于同龄男性外，AHA男女发病率基本相同。AHA病情凶险，需要及时地诊断和治疗。AHA治疗方案主要分为止血治疗与抑制物清除治疗两部分32,33o（三）VWDVWD是由VWF基因突变导致血浆VWF数量减少或质量异常的一种常染色体连锁的遗传性出血性疾病。VWD患者一般自幼发病，表现为皮肤瘀点瘀斑、鼻出血和齿龈出血，女性月经增多。根据发病机制可分为3型：（1）1型：VWF量的减少，可细分为1型和IC型，部分
8、患者可无自发性出血表现；（2）2型：VWF质的缺陷，可细分为2A、2B、2M和2N型；（3）3型：VWF量的显著减少或缺如，出血表现较为严重。在诊断VWD时，需进行其他实验室检查以将其与HA等出血性疾病进行鉴别诊断10,34,35,36,37o三、FV1.II活性检测（一）样本准备应使用含0.109mo1./1.（3.2%）枸檬酸三钠抗凝剂（1：9抗凝）抗凝管进行FVIII:C检测血样采集。样本采集后，室温条件下（1825）应在1h内送检并分离血浆。在分离血浆时，将装有标本的带盖试管在规定的速度和时间条件下（室温、1500Xg、不少于15min）,以得到乏血小板血浆（p1.ateIet-poo
9、rpIasma,PPP）（血小板计数10X1091.）o若患者的红细胞比容255%,应按要求进行抗凝剂比例的调整38,39o（二）检测方法1 .一期法：一期法主要是基于待测PPP对乏FVII1.基质血浆APTT的纠正能力2,4,7,8,20,通过检测APTT的时间可计算FVIII:Co其检测过程如下：将待测PPP经一定比例稀释（一般为10倍稀释）后，与等量乏FVII1.基质血浆混合，进行APTT检测。检测结果与待测PPP中FVIII:C呈负相关。用已知FVIII:C的血浆或标准品进行梯度稀释后建立定标曲线，将该检测结果代入定标曲线，便可计算得到待测PPP中的FVIII:C1,3o一期法目前仍然
10、是国内乃至全世界应用最广泛的FVIII:C检测方法1,2,3,4,5,13o但一期法可能受其他内源性凝血因子抑制物（如F1.X抑制物）、狼疮抗凝物质和肝素等干扰APTT纠正能力的物质影响，从而造成FVIII:C假性降低24o同时随着血友病治疗新方法的不断出现，如抗体类药物的应用，一期法检测不能用于其治疗效果的监测。2 .二期法：二期法主要是基于检测FV1.i1.作为辅因子与F1.Xa形成复合物活化FX的能力，通过检测生成的活化FX（activatedcoaguIationfactorX,FXa）的量可计算FVIII:Co其检测过程如下：第一步，将待测PPP与含有P1.、Ca2+.F1.Xa和F
11、X的试剂溶液进行孵育后生成FXa;第二步，再加入过量的凝血酶原和纤维蛋白原，检测纤维蛋白凝块形成的时间。测得的凝固时间可以通过查对已知FVIII:C的定标曲线或代入回归方程，得到待测PPP中的FVIII:C1O二期法抗干扰能力较一期法强，但其操作繁琐，耗时较长，难以自动化2o国内基本没有实验室开展。3 .发色底物法：二期法经过方法改进后，发展为发色底物法，其原理与二期法基本一致：第一步：待测PPP与含有P1.、Ca2+.F1.Xa和FX的试剂溶液进行孵育后生成FXa;第二步加入发色底物，FXa可使其释放对硝基苯胺，后者可在405nm波长条件下通过读取吸光度值计算该物质的生成量，进一步通过计算转
12、换为FVIII:C1,2,3,4,8,20,40o发色底物法抗干扰能力较一期法强20,可实现自动化仪器检测，在国内已有少数专业实验室开展。随着检测手段的不断更新，发色底物法在临床的应用也不断增加。（三）检测系统实验室在选择检测系统时，应将临床标本性状、标本数量与检测速度等因素纳入考虑。黄疸、脂血等因素会干扰以光学法为原理的检测系统的检测结果，可改用手工或基于磁珠原理的检测系统进行测定。同时，实验室宜选用仪器与试剂配套的检测系统。使用非配套检测系统时，应确认该系统是否能满足性能验证要求。性能验证至少应包括批内精密度、批间精密度、正确度和可报告范围等38。（四）室内质量控制实验室可使用商业质控血浆
13、或自制质控血浆(冰冻血浆)进行室内质量控制(interna1.quaIitycontroI,IQC),质控血浆应至少具有2个浓度水平(包含正常水平和异常水平)，使用自制质控血浆时应与商业质控血浆进行同步检测以评价其适用性。应根据检测标本量或检测批次确定室内质控的频率，并保证每次开机检测标本前至少进行一次正常水平和异常水平的室内质控；使用新开瓶/新复溶试剂进行标本检测前，宜首先进行质控品检测。每个批号质控血浆在使用前，应由实验室通过检测确定均值和允许范围，质控品制造商规定的“标准值”和“允许范围”只能作为参考。室内质控建议选用Westergard质控规则，至少包括13s和22s规则，其余可根据实
14、验室实际情况酌情选用38。2014年，国家卫生健康委临床检验中心及上海交通大学医学院附属瑞金医院专家针对FVIII和FIX实验室检测进行了问卷调查研究，结果显示：39%(28/72)的实验室未开展室内质控，21%(15/72)的实验室仅检测正常水平质控物，个别实验室室内质控累计变异系数超过30%41。由此可见，国内实验室在FVIII:C检测方面仍有较大改进空间。(五)室间质量评价实验室应参加室间质量评价机构组织开展的室间质量评价活动，以保证采用相同实验室检测系统之间结果的可比性；对于没有开展室间质量评价的项目应进行实验室间结果比对，以保证不同实验室之间结果的可比性38o一项来自英国国家外部质量
15、评估计划调查研究结果显示：检测同一重型HA患者FVIII:C时，各实验室检测结果间的变异系数在33%106%42o但根据2014年国家卫生健康委临床检验中心及上海交通大学医学院附属瑞金医院专家共同开展的问卷调查研究结果，国内76%(55/72)的实验室未参与FVIII:C的室间质评计划，其中仅18%(10/55)进行了实验室间结果比对41o这充分说明了建立FVIII:C的全国室间质评计划的重要性和迫切性。目前，我国国家卫生健康委临床检验中心()已开展了FVIII：C检测的室间质评项目。四、FVII1.活性检测的影响因素(一)基因突变在大多数轻型或中间型HA患者中，一期法和二期法/发色底物法之间
16、FVIII:C检测结果存在系统性差异20,但在重型HA患者中未观察到存在差异。1976年Rogers和Eyster43报道了二期法检测FVIII:C结果低于一期法的现象，这些患者出血表现与二期法结果更为符合。但在2002年MUmford等44报道了截然相反的现象，即二期法/发色底物法检测FVIII:C结果高于一期法2,且这些患者很少或没有出血表现1。基因缺陷发生在A1-A2-A3区的患者，其一期法检测FVIII：C结果高于二期法/发色底物法。这可能是由于A1-A2-A3区的突变导致FV1.I1.a异三聚体稳定性降低并增加了A2区的解离。二期法/发色底物法反应时间更长，可能导致基因缺陷对其影响更大1,8o
