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1、胃癌患者外周血CD4+T细胞IncRNA心肌梗死转录本表达水平及其意义胃癌发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中位于前列，因其早期症状不明显，很多患者就诊时已发展到晚期，预后差1。临床上广泛用于辅助胃癌诊断及评估预后的血清肿瘤标志物有癌胚抗原(CarCinoen1.bryoniCantigen,CEA)和糖类抗原(CarbOhydrateantigen,CA)199,但灵敏度低，诊断效能不高。因此，需要更加可靠、敏感和特异的胃癌分子诊断标志物。CD4+T淋巴细胞是一类辅助型T细胞，在协调机体引发针对肿瘤的细胞免疫和体液免疫中起关键作用，其中调节性T细胞(regu1.atoryTCe1.1.,Treg)
2、越来越受到广泛关注2。近年的研究表明，胃癌患者的外周血Treg细胞水平高低与肿瘤患者的预后密切相关，其水平越高预示着临床分期越晚、预后越差，并可作为判断胃癌预后的独立因素3o长链非编码RNA(Iongno-codingRNA,IncRNA)心肌梗死转录本(myocardiaIinfarctio-associatedtranscription,MIAT)在多种肿瘤中异常表达，参与肿瘤的发生发展，并且能够在患者血清中检测到，可以作为潜在的肿瘤生物学标志物4,5,6o此外，InCRNAM1.AT在肝癌组织浸润的Treg细胞中高表达，参与了肝癌细胞的免疫逃逸7。胃癌细胞中，InCRNAM1.AT发挥癌
3、基因的作用促进癌细胞增殖和侵袭转移8,9;胃癌患者血清中，IncRNAMIAT水平显著升高，在胃癌的诊断和预后评估中具有一定的价值10o本研究通过检测分析了IncRNAMIAT在124例胃癌患者，90例胃良性疾病患者和80名健康对照者的外周血CD4+T细胞内的表达情况，评价其作为胃癌生物学标志物的可行性，为胃癌的临床辅助诊断提供依据，探索其与胃癌患者病情发生发展的关系。对象与方法一、对象1.胃癌组：收集2019年1月至2021年4月在江苏省泰州市人民医院就诊的124例胃癌患者，其中男84例，女40例；年龄(65.6511.49)岁。纳入标准：取材前患者尚未接受抗肿瘤治疗；经病理组织学确诊为胃癌
4、；无其他部位肿瘤。2 .胃部良性病变组：选取同期诊治的胃部良性病变患者90例，其中男51例，女39例；年龄(62.799.68)岁，其中慢性浅表性胃炎11例，糜烂性胃炎21例，萎缩性胃炎12例，胃溃疡18例，胃息肉26例，胃良性肿瘤2例。3 .健康对照组：选取同期80名本院体检中心的体检健康者作对照组，其中男45名，女35名；年龄(63.210.1)岁。健康志愿者均行胃镜检查，排除胃恶性肿瘤和良性病变。3组性别(2=3.84,P=O.147).年龄(F=2.292,P=O.103)等一般资料比较，差异无统计学意义。本研究经泰州市人民医院医学伦理学委员会批准（KY2019123）,所有受试者知情
5、同意。二、方法1.仪器与试剂:1.ightCyCIer480I1.实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）;i2000SR全自动化学发光仪（美国雅培公司）；转录试剂盒ReVertAidTM第一链CDNA合成试剂盒（美国Thermo公司）；MIAT和内参3-磷酸甘油醛脱氢酶（gIyceraIdehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）荧光定量PCR上、下游引物（上海生工生物工程股份有限公司）；i2000SR全自动化学发光仪（美国雅培公司）；人淋巴细胞分离液（美国GE公司）；磁力架、CD4+磁珠及试剂盒、MS分离柱（德国Mi1.tenyiBiOteC公司）；Ch1
6、.P试剂盒（美国UpstateBiotechnoIogy公司）；抗m6A抗体（美国EMDMi1.1.iPOre公司）；ACS溶血素、单抗、鼠抗人CD4-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物（CD4-Peridinin-Ch1.OrOPhy1.1.-PrOteincompIex,CD4-PerCP）、单抗、鼠抗人CD25-藻红蛋白（CD25-phycoerythrin,CD25-PE）、单抗、鼠抗人CD127-异硫氯酸荧光素（CD127-fIuoresceinisothiocyanate,CD127-FITC）以及其同型对照鼠抗人免疫球蛋白G-藻红蛋白/免疫球蛋白G-异硫氯酸荧光素（IgG-PE/Ig
7、G-FITC）抗体均为美国BD公司产品；流式上样管及FACSCa1.ibur型流式细胞仪均购自美国BD公司。2 .CD4+T淋巴细胞分选和鉴定：清晨空腹采集患者和健康者外周血各Ion1.I,加入淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法，分离患者和健康者外周血单一核细胞(peripheraIb1.oodmononucIearce1.Is,PBMC)o按照CD4+磁珠分选试剂盒产品说明书分选PBMC中的CD4+T淋巴细胞，分选后的每管细胞均采用流式细胞仪进行鉴定，其分选纯度均大于95%。3 .CD4+CD25+CD1271.ow-Treg检测：100I抗凝全血管内依次加进5I的鼠抗人CD4-FITC、C
8、D25-APC以及CD127-PE单抗，充分混匀，避光放置12min,加进1m1.溶血素10min,离心(500g5min)弃上清，加入300I的磷酸盐缓冲盐溶液(phosphatebufferedsa1.ine,PBS)悬细胞,放入流式细胞仪中开展检测。分别加进同种型号的鼠抗人CD4-FITC.IgGI-APC以及IgGI-PE单抗当作阴性对照。Treg水平采取CD4+CD25+CD1271ow-Treg于CD4+T细胞内的占比表示。4 .实时荧光定量聚合酶链反应检测：M1.AT上游引物为5,-Ggacgttcacaaccacactg-S,下游引物为5-TCCCACTTTGGCATTCTAG
9、Gy;GAPDH上游引物为5,-TgatgacatCAAGAAGGTGGTGAAG-3,下游引物为5,-Tccttggaggcccagtgggccat-S,。采用1.ightCyCIer480进行荧光定量PCR检测。反应体系：SYBRGreen1.荧光染料10I,cDNA3I,上游引物1I,下游引物1I,H205I,总体积20IoPCR反应条件为：95,5min,1个循环；95,15s；60,30s；72,30s,共40个循环。每个样本设2个复孔，结果取其均值。用2-AACt来表示MIAT的相对表达量，其中ACt二实验组(CtMIAT-CtGAPDH)-对照组(CtMIAT-CtGAPDH)。
10、5 .染色质免疫共沉淀联合定量聚合酶链反应(chromatinimmunoprecipitationquantitativepoIymerasechainreaction,Ch1.P-qPCR):使用Ch1.P-QPCR检测胃癌患者外周血与健康者外周血CD4+T细胞m6A与IncRNAM1.AT基因之间结合活性的变化。外周血CD4+T细胞甲醛固定后甘氨酸终止反应，裂解细胞后用超声破碎仪进行破碎，将染色质打断成2001000bp的片段。按照Ch1.P试剂盒的说明将裂解液与稀释缓冲液和蛋白A琼脂糖进行预孵育，留取对照放4冰箱保存备用，剩余部分分为2份，1份加入IgG抗体，另一份则加入等量的抗m6A
11、抗体，置于4C摇床颠倒混匀过夜。第2天，经过吸附、洗涤以及洗脱后进行逆交联，获得DNAo抽提纯化洗涤后，所得DNA溶于去离子H20中。定量PCR检测，所用引物为：上游引物5,-TGCACTGCTCCTGGATTCTG-3,下游引物5-CTGCTCTCTTGCAAACGCTG-3,。用2-ACt来表示m6A与M1.AT基因结合的水平,其中AACt=(Ctm6A-Ct1.nput)(CtIgG-CtInput)o6 .血清癌胚抗原(careino-embryonicantigen,CEA)和糖类抗原(carbohydrateantigen,CA)199含量检测：采用全自动化学发光仪发光法检测CEA
12、和CA199o7 .统计学分析：采用SPSS22.0软件进行统计分析和受试者工作特征(receivoroperatingcharacteristic,ROC)曲线生成。年龄等计量资料，符合正态分布的，用均数土标准差表示；3组间比较采用方差分析，其组内采用1.SD法进行两两比较；不符合正态分布的，用M(Q1,Q3)表示，3组间比较采用KrUSkaI-Wa1.IisH检验，胃癌、胃良性病变及健康对照各组外周血CD4+T细胞中MIAT的相对表达量其组内两两比较采用Bonferroni进行校正。胃癌组外周血CD4+T细胞中MIAT的相对表达量与临床病理特征间的相关性分析用X2检验，外周血CD4+T细胞
13、中MIAT的相对表达量与Treg细胞水平之间的相关性用Spearman检验。使用ROC曲线评估CD4+T细胞中MIAT对胃癌的诊断能力。P1.511(0.916,1.855)和0.963(0.729,1.432),3组间差异有统计学意义(H158.25,P0.001)。胃癌患者外周血CD4+T细胞中IncRNAMIAT的表达水平较胃良性疾病患者以及健康对照组明显上调，差异有统计学意义(Z=100.63,145.14,P均0.001)o胃良性疾病患者与健康对照者MIAT的相对表达量差异亦有统计学意义(Z=44.52,P=O.002)o二、胃癌组、胃良性病变组和健康对照组外周血CD4+T细胞m6A
14、与M1.AT基因结合活性的比较取健康者外周血CD4+T细胞基因组DNA,应用m6A抗体进行ChIP检测。CD4+T细胞中，m6A能够与所设计的MIAT基因片段相结合(图1)。进一步取胃癌组早期患者(I期)和晚期患者(IIIV期)各5例外周血CD4+T细胞基因组DNA.胃良性病变组5例患者外周血CD4+T细胞基因组DNA.健康对照者5例外周血CD4+T细胞基因组DNA,ChIP-QPCR检测m6A与MIAT基因结合情况。胃癌早、晚期患者CD4+T细中m6A与M1.AT基因启动子的相对结合活性分别为(8.5901.483)和(4.2740.425),差异有统计学意义(t=6.255,P=O.002
15、)；胃癌早、晚期患者m6A与M1.AT基因的结合活性显著低于胃良性病变患者(17.2673.106)和健康对照组(27.6373.945)(t=-7.331、-12.832,P均0.001)。bp2OOO1000750500250100注：1为DNA标准带，2为对照，3为IgG,4为m6A.m6A示6-甲基腺瞟岭；目的条带113bp图1m6A与MIAT基因启动子结合三、胃癌患者外周血CD4+T细胞MIAT相对表达量与临床病理特征的关系124例胃癌患者MIAT相对表达量与年龄(X2=0.000,P=1.000)、性别(2=0.000,P=1.000).CEA水平(2=0.6481二0.421)和。A199水平(*2=1.554,P=0213)无关,在不同TNM分期(2=23.571,P=O.002)、不同肿瘤大小(2=9.443,P0.01).有无淋巴结转移(X2二45.248,P0.01)中差异有统计学意义，见表1。相关性分析表明，MIAT相对表达量与年龄之间(r2=0.0022,P=O.602)、MIAT相对表达量与CEA水平(r2=0.0004,P=O.798)均无相关性，MIAT相对表达量与CA199水平(r2=0.0783,P=
