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1、,.Z-1-刖三色谱分离是建立HPLC方法的首要考虑因素,深刻理解实验色谱参数如何影响分离效果，可以很好的帮助我们建立分析方法，运用HPLC技术解决研发过程中遇到的分析问题。反相色谱方法（RPC）开发的一个重要开始起点，是选择合适的色谱条件，为一个给定的样品提供一个可靠的分离结果。两个色谱峰的分离度通常采用它们的保留时间和峰宽计算得到：Rs=2tR（j）-tR（i）（Wi+Wj）,Wi和Wj代表色谱峰i和j的峰宽。色谱峰保留因子与保留时间的关系：k=（tR-tO）tO色谱峰宽、理论塔板数、保留因子的关系：W=4N-0.5t0（l+k）由上面公式，可以导出色谱峰间分离度与保留因子、选择因子和理论
2、塔板数之间的简单关系：分离度可以划分为三项：a项（第一个峰的保留因子），b项（分离因子）和c项（柱效或塔板数）。从这个公式中可以看出两个色谱峰之间的分离度，与峰保留因子、选择因子和理论塔板数密切相关。通过改变这三项中的任意一项的值，都可以改善峰之间的分离度，其中提高分离选择性（Q）,是最有力的方法。图1是等度条件下的分离度公式，下图2是梯度条件的分离度公式。图2：分离度公式（梯度）当需要分离多个色谱峰时，对于分离程度最差的一对色谱峰来说，分离度的要求是R2.0o这一对色谱峰通常被称为关键色谱峰对。它们的分离度是方法优化关注的焦点。方法建金器开发时，第一步关键是选择一根柱效足够、选择性较好的色谱
3、柱,色谱柱固定相是影响选择性最大的因素；依次是改变溶剂的强度，使色谱峰保留因子k值落在合适的区域范围，优化选择性,最后是调整柱子的柱效塔板数，得到最优的分离度和分析时间。图3：色谱参数对分离度的影响1 .保留因子k的优化样品的保留因子k可以通过样品的保留时间和方法的死时间计算得到，k=（tR-tO）tO死时间t可以通过色谱柱柱长近似计算，tO=O.OlL,L为色谱柱长度（单位mm）o当选定色谱柱后，t是一个常数，因此k值的大小可以通过改变有机相的组成（B%）来控制。通常k值控制在IWkWIO范围比较合适，如图3。图3相对分离度与k值的关系k=10时，当其它影响因素不变时，k值的增加几乎不再改善
4、分离度，只会延长样品的保留时间。当分析方法用于制剂分析时，k2时，目标峰可以很好的与一些没有保留的辅料干扰峰分离。RPC的保留会随着有机相比例B的改变而变化，表达为：Iogk=Iogkw-SG中是B溶剂的体积（为0.01*%B）,kw是当为。时的保留因子，S为常数,对于分子量100-500Da的化合物来讲，S4o因此中每增加0.1个单位（+10%B）,k值相应的减少到原来的1/10,或下降2.5倍。反之，每减少0.1个单位（-10%B）,k值相应的增加2.5倍。如例1：80%的流动相B作为初始条件，0.3k0.8o当流动相B为70%时;峰1的k=2.5*0.3Q0.8,最后一个峰为0.8*2.
5、5=2;依次降低有机相B的比例，找到合适的k值，如c,1.8k66上述计算中的“2.5倍法测”只是一个粗略的方法，能够给出一个近似值参考。vM(分仲)l.8A6)A,4so*耶解 (OJcicas)1.IJU3.A,尺246时H(分*)50%甲卸(4C&CI9)例1：分离效果和k随流动相中B的变化而变化2 .选择性Q的优化选择性与保留因子间的关系如：Q=k2kl,色谱峰的选择性可以通过调节它的相对保留来改变。色谱条件有机相B%比例、B溶剂类别、柱温、柱子类型、流动相PH值、缓冲液离子浓度、离子对试剂浓度等对色谱的相对保留有影响。表1：不同分离条件对保留因子、选择性和塔板数的影响。条件kaNB.
6、R常制（乙M,甲R7等）-M度色谎柱的美*“：三茶禁,氟从等）渔动相的pr40冲港修度.A财试剧的浓度色谓杵的长度00陀大小00流速00IK力-一.心如例2：B%的改变可以使得k值落在合适的范围内，但需要进一步优化条件。因此通过调整B%比例和柱温，使得六个色谱峰都达到了分离的要求，如d。这个例子是改变选择性的一个简单且典型的示例，通过两因素两水平的改变，设计四个实验，可以达到优化方法的最终要求。3O%B.3OT (b) 4C&CI2O 2468 IO(分仲)(d) 20%B.47T 420 R =4.045%BJOT,2Ty(Wz+Wj)(式1)利用保留时间以及半峰宽，按照下式2进行计算；Re
7、solution=1.18(Tj-Ty(Wfcl+Wu)(式2)各参数意义详见下图2所示。(3)利用色谱柱柱效(N),分离因子()以及保留时间较长的组分的容量因子(K),按照下式2进行计算；RttohUiOnT(U)(含)(式3)上述三个公式，理论上都可以对分离度进行计算，但公式3需要得到色谱柱的柱效，而对色谱柱而言，针对不同的化合物其柱效是不一样的，尽管仪器操作条件完全相同。因此，该式更多应用于理论推导。上述公式1与公式2则更多应用于实际色谱图中相邻洗脱组分色谱峰分离度的计算。对于公式1,其应用范围是两色谱峰基本基线分离及其以上的情况，因为该式需要测定明确的基线峰宽；当基线峰宽不能明确测量时
8、(如两相邻组分色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值小于50%时，如图3所示)，则比较适宜选择公式2计算分离度，因为该式测量的是半峰高处的峰宽。12峰高比法预测分离度公式1以及公式2可解决基线分离以及色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值小于50%时，对于两相邻色谱峰分离度的计算需求。当两相邻组分色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值大于50%时（如图4所示），由于无法精确测量基线峰宽以及半峰高峰宽，使用公式1以及公式2计算分离度受到很大程度的限制。如图4所示，关键色谱峰对A,B,C色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值超过50%,无法精确测量基线峰宽以及半峰高处峰宽，这也是一些计
9、算机数据处理系统无法给出一些关键峰对分离度的原因。从理论上讲，组分经色谱柱分离之后被检测器检测到的信号强度分布在时间轴是高斯分布（正态分布）的，经由计算机结合色谱分离塔板理论对相邻组分的分离色谱图进行模拟（如下图5A及5B所示）。将分离度大小（经由公式1或公式2计算得到）与两色谱峰峰高以及色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值进行关联，得到分离度与峰高比关系表（表1）,用于对重叠色谱峰分离度进行预测。VW”HightPeak-heightratio:1：11.33:12：14:110:1100:1凡1,4m27%1.310%13%19%43%1211%13%16%21%31%64%1.1
10、1820%25%33%47%87%1.027%31%38%50%68%0.940%45%54%71%91%0.85563%75%93%0.774%&4%96%0.691%当然上述表格中预测方法也存在局限性，当两色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值大于90%时，由于两色谱峰严重重叠，两重叠色谱峰各自峰高均大于单独峰高（图5B,A）,此外当两重叠色谱峰高度比大于100时，峰高大的色谱峰几乎将小的色谱峰完全覆盖（图5B,C）,此时使用该方法得到的分离度显然是不符合实际情况的。2影响分离度因素多种因素可影响分离度的大小，其中为大家所熟知的是色谱柱的柱效，流动相的选择以及温度，流速等。此外，色谱峰的峰形，峰宽以及检测器相关参数的设置亦会影响分离度的大小。2.1. 色谱峰峰形与峰宽对分离度的影响由检测器实际检测到的经由色谱柱流出组分的浓度响应信号强度，大多数情况下不是标准的高斯分布轮廓，可以色谱峰不对称因子以及色谱峰拖尾因子对色谱峰的峰形进行评价。不对称因子可按照As=BZA计算得到，其中B为10%峰高处后半部分色谱峰的峰宽，A为前半部分峰宽（如图6A所示）；拖尾因子可按照Tf=C2D计算得到，其中C为5%峰高处峰宽，D为色谱峰前半部分峰宽（如图6B所示）。一般地，不对称因子要N拖尾因子，二者相对大小如下表2所述。Peak Tailing Factor (at 5%)1.01.2
