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1、ICSCCSB04B54西臧自治区地方标准DB54/TXXXX-XXXX青棵及其制品中5种黄酮类化合物的测定高效液相色谱法点击此处添加标准名称的英文译名（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。XXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施西藏自治区市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由西藏自治区农牧业标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所、西藏自治
2、区农畜产品工程技术研究中心。本文件主要起草人：青棵及其制品中5种黄酮类化合物的测定高效液相色谱法1范围本文件规定了青棵及其制品中芦丁、儿茶素、杨梅素、瓶皮素、山奈酚高效液相色谱测定方法的试样制备、分析步骤、结果计算、检出限、定量限和精密度。本文件适用于青棵及其制品中芦丁、儿茶素、杨梅素、棚皮素、山奈酚5种黄酮类化合物含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法原理试样用75%甲醇
3、溶液超声提取后，经C8色谱柱分离，紫外检测或二极管阵列检测器检测，根据保留时间定性和外标法定量。4试剂与材料除另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。d1试剂4.1.1甲醉(CH3OH,CAS号：67-56-1)：色谱纯。4.1.2甲酸(HCooH,CAS号：64-18-6)：色谱纯。4.1.3乙胞(CH3CN,CAS号:75-08-8)：色谱纯。4.1.475%甲静水溶液(V/V)：取甲静750mL,用超纯水稀释至IOoOmL,混匀。4.1.50.1%甲酸-水溶液(V/V)：取甲酸ImL,用超纯水稀释至IoOOmL。4.1.60.1%甲酸-乙脐溶液(V/V)：取甲酸I
4、mL,用乙腑稀释至IooOmL。43标准品芦丁标准品(C27H30Oi6,CAS号：153/8-4)、儿茶素标准品(C15H46CAS号：154-23-4)、杨梅素标准品(C15Hi0O8,CAS号：529442)、制皮素标准品(Ci5Hi0O7,CAS号：117-39-5)、山奈酚标准品(C5Hio06,CAS：520183)纯度298.0%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。41标准溶液配制4.3.1标准储备溶液：分别准确称取儿茶素、芦丁、杨梅素、棚皮素、山奈酚标准品各5.0mg,用甲醇溶液配置成500mg/L的单标储备液，于-18C避光保存。4 .3.2标准工作溶液：分别吸取适量
5、的标准储备液，用75%甲醇稀释成儿茶素浓度为：12mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L、Ioomg/L、15Omg/L、200mg/L；芦丁、杨梅素、棚皮素及山奈酚浓度为2mg/L、4mg/L、10mgL20mg/L、50mg/L、100.0mg/Lx200.OmgzL的混合标准工作溶液。5仪器和设备Kl高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。A5分析天平：感量0001go5 1涡旋振荡器。S4氮吹仪。K4超声波萃取仪。KA低温冰箱：温度为-20C以下。，7离心机：转速为6000r/min50rmin(Sfl微孔滤膜：0.22m,有机系。6试样制备取干燥的待测样品适量，用
6、组织捣碎机将其粉碎成粉末状并充分混匀，用密封袋密封后放置于干燥皿中备用。7分析步骤71提取称取试样2.0g(0.01g),于50mL塑料离心管中，加75%甲醇溶液IOmL涡旋混匀后超声提取90min,于6000r/min离心5min,取适量上清液过0.22Jm滤膜，待高效液相色谱测定。70液相色谱参考条件a)色谱柱：C18色谱柱(4.6mmX250mm,5m),或相当者；b)流动相：A为水相：0.1%甲酸，B为有机相：0.1%甲酸.乙脐；c)流速：l.OmL/min；d)柱温：30C；e)进样量：10L;f)检测波长：270nmo流动相梯度洗脱程序见表1：表1梯度洗脱程序时间(min)A(%)
7、B(%)095V5.0082189.00227810.004060时间(min)A(%)B(%)11.00406013.0095515.0095571标准工作曲线的制作取适量标准工作溶液，按照8.2规定的色谱条件测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，建立标准工作曲线。5种黄酮类化合物标准溶液色谱图见附录A。74样品溶液测定将8.1制备的样品溶液进行高效液相色谱仪分析，待测试样溶液中儿茶素、芦丁、杨梅素、棚皮素和山奈酚的响应值应在仪器线性相应范围内。以标准溶液色谱峰的保留时间定性，以标准溶液色谱峰峰面积和试样峰峰面积比较定量，由标准工作曲线查得试样溶液中儿茶素、芦丁、杨梅素、梅
8、皮素和山奈酚的浓度。8结果计算试样中各组分（儿茶素、芦丁、杨梅素、褪皮素、山奈酚）的含量以砂分别按公式（1）计算。式中：W试样中某一黄酮类化合物的含量，单位为毫克每千克（mgkg）；c从标准工作曲线得到的试样溶液中各组分的质量浓度，单位为亳克每升（mgL）；V提取溶液甲醇体积，单位为毫升（mL）；机试样的质量，单位为克（g）O计算结果以重复性条件下获得的2次平行测定结果的算术平均值表示，结果保留小数点后两位。9检出限、定量限和精密度O1检出限和定量限青棵及制品中儿茶素、芦丁、杨梅素、棚皮素、山奈酚的检出限依次为：4.0Omg/kg、0.40mgkg0.50mgkg0.5Omg/kg、0.2Omg/kg。青棵及制品中儿茶素、芦丁、杨梅素、棚皮素、山奈酚的定量限依次为：1200mgkg1.5Omg/kg、2.00mgkg2.0Omg/kg、0.50mg/kgo05精密度在重现性条件下，获得2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的15%；在再现性条件下,获得2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%o附录A（资料性）5种黄酮类化合物选择离子监测（SRM）色谱图mAUMaxIntensity:11,30110.0-7.5-5.0-2.5-。正5*06*07*08*09*010.011.012.013.014.0mi图A.15种黄酮类化合物选择离子监测（SRM）色谱图
