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1、附件15牙膏中金黄色葡萄球菌检睑方法DetectionofStaphylococcusAureusinToothpaste1范围本规范规定了牙膏中金黄金色葡萄球菌的检验方法。本规范适用于牙膏中金黄色葡萄球菌的检验。2定义金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。3仪器和设备3.1 显微镜。3.2 恒温培养箱：360ClCo3.3 离心机。3.4 无菌吸管：ImL（具0.01mL刻度）、IOmL（具QlmL刻度）或者移液器及吸头。3.5 试管：18mmxl50mm03.6 载玻片。3.7 酒精灯。3.8 三
2、角瓶：250mL。3.9 高压灭菌器。3.10 恒温水浴箱。4培养基和试剂4.1 SCDLP液体培养基见总则中3.1。4.2 营养肉汤成分：蛋白陈10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸储水加至100OmL制法：将上述成分加热溶解，调PH为7.4,分装，121高压灭菌15min。4.37.5%氯化钠肉汤成分：蛋白膝牛肉膏氯化钠蒸储水加至制法：将上述成分加热溶解，10g3g75g1000mL调PH为7.4,分装，121C高压灭菌15min。4.4BairdParker平板成分：胰蛋白陈牛肉膏酵母浸膏丙酮酸钠甘氨酸氯化锂(LiCl6H2O)琼脂蒸储水增菌剂的配制：30%卵黄盐水于冰箱内。制法：将各成分加到蒸馆
3、水中瓶95mL,高压灭菌15min010g5g1g10g12g5g20g950mLpH7.00.250mL与除菌过滤的1%亚稀酸钾溶液IOmL混合，保存,加热煮沸完全溶解，冷至25C1C,调节pH。分装每临用时加热溶化琼脂，冷至50,每95mL加入预热至50C左右的卵黄亚硅酸钾增菌剂5mL,摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱贮存不得超过48h2ho4.5 血琼脂平板成分：营养琼脂100mL脱纤维羊血(或兔血)IOmL制法：将营养琼脂加热融化，待冷至50C左右无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用。4.6 甘露醇发酵培养基成分：蛋白陈10g氯化钠5g甘露醇10g牛
4、肉膏5g0.2%麝香草酚蓝溶液12mL蒸播水1000mL制法：将蛋白腺、氯化钠、牛肉膏加到蒸馅水中，加热溶解，调PH为7.4,加入甘露醇和指示剂，混匀后分装试管中，68.95kPa(115101b)20min灭菌备用。4.7 灭菌液体石蜡制法：取液体石蜡50mL,121C高压灭菌20min。4.8 兔（人）血浆制备取3.8%柠檬酸钠溶液，12Ie高压灭菌30min,1份加兔（人）全血4份，混匀静置；2000rpm3000rpm离心3min-5min。血球下沉，取上面血浆。5操作步骤5.1 增菌：取1:10的检液10mL接种到90mLSCDLP液体培养基中，置36C1C培养箱，培养24h2h5.
5、2 分离：自上述增菌培养液中，取12接种环，划线接种到BairdParker平板上，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板上，置36C1C培养48h2ho在血琼脂平板上菌落呈金黄色，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在BairdParker平板培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36C1C培养24h2h.5.3 染色镜检：挑取血琼脂平板上分纯后的菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，
6、排列成葡萄状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5mlm05.4 甘露醇发酵试验：取血琼脂平板上分纯后的菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在培养基液面上加入高度为2mm3mm的灭菌液体石蜡，置36C1培养24h2h,金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。5.5 血浆凝固酶试验：吸取1:4新鲜血浆0.5mL,置于灭菌小试管中，加入待检菌24h2h营养肉汤培养物0.5mL,混匀，置36C1C恒温箱或恒温水浴中，每半小时观察一次，6h之内如呈现凝块即为阳性。同时将已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株的营养肉汤培养物及营养肉汤培养基各0.5mL,分别加入无菌1:4血浆0.5mL,混匀，作为对照。也可使用商品化试剂，按照说明书操作，进行血浆凝固酶试验。5.6 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统，可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落，用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。6检验结果报告被检样品经增菌分离培养后，平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证实为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。
