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1、2024胎儿短肢畸形的基因突变位点筛查摘要目的研究胎儿短肢畸形的致病基因突变位点。方法2008年8月至2011年8月,妊娠18-24周和(或)3032周常规胎儿超声检查发现胎儿肢体明显短小者共10例,知情同意后引产终止妊娠,同时抽取羊水或脐带血进行胎儿染色体核型分析。采用聚合酶链反应及直接测序技术检测羊水或脐带血成纤维细胞生长因子受体3(fibroblastgrowthfactorreceptor3,FGFR3)基因的热点突变位点。染色体及FGFR3基因检测异常胎儿的双亲进行FGFR3基因相同部位的测序。1例胎儿(病例3)颅骨骨化差,考虑软骨生成不全,进行FGFR3基因全部外显子及SLC26A
2、2,Trip11基因外显子测序。结果10例短肢畸形胎儿,妊娠中、晚期各检出5例,均引产终止妊娠。染色体核型分析发现1例为嵌合体(46双丫/45双丫,-18),余9例正常。10例胎儿全部进行了FGFR3基因热点突变部位的检测,发现4例基因突变。其中1例为罕见的c.1108GT(G370C)突变,胎龄21+3周,诊断致死性骨发育不良另3例胎龄3032周胎儿为FGFR3c.1138GA(G380R)突变,明确诊断为软骨发育不全。4例基因突变胎儿的双亲均未见相同位点突变,再发风险低,其中3例胎儿母亲目前已再次妊娠分娩,新生儿无异常。病例3胎儿FGFR3基因全部外显子及SLC26A2,Trip11基因检
3、测均未发现致病突变。结论染色体及FGFR3基因热点突变部位的检测可为部分短肢畸形胎儿明确致畸原因,为患病家庭提供准确的遗传咨询及再次妊娠的产前诊断;妊娠晚期超声发现胎儿肢体明显短小,应考虑软骨发育不全。【关键词】软骨发育不全;受体,成纤维细胞生长因子,3型;超声检查,产前;突变胎儿骨骼发育异常是临床常见的出生缺陷之一,绝大多数是遗传性疾病,种类繁多,产前超声检查不能确定其具体类型,甚至出生后普通尸体解剖也难以确定诊断1L给遗传咨询带来很大困难。妊娠期常见的胎儿骨骼畸形包括成骨不全II型(OSteOgeneSiSimperfecta11)x致死性骨发育不良(thanatophoricdyspla
4、sia)x软骨生成不全(achondrogenesis)等占所有病例的40%。此外还有软骨发育不全(achondroplasia)、肢体屈曲症(CamPtOmeliCdySPIaSia)、短肋-多指综合征(shortrib-polydactylysyndrome).软骨外胚层发育不全等2。胎儿骨骼发育异常常以肢体不同程度的短小为主要临床表现,即短肢畸形(shortlimbsdeformity)o可以为常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传及X连锁遗传,病因不同则再发风险也不同3。因此,妊娠期发现胎儿骨骼畸形后应该尽可能明确诊断和查找致病原因,为患者提供较准确的遗传咨询和产前诊断。本研究对近3年因短
5、肢畸形在本院引产的10例胎儿进行了染色体以及成纤维细胞生长因子受体3(fibroblastgrowthfactorreceptor3,FGFR3)基因热点突变位点的检测赧道如下。资料与方法一、临床资料2008年8月至2011年8月,本院产前检查的孕妇均于妊娠1824和(或)3032周常规进行胎儿超声检查,共检出10例胎儿肢体明显短小(股骨长度小于相同孕周2个标准差以上),知情同意后均引产,并对引产胎儿进行尸体解剖。二、研究方法1 .胎儿染色体核型分析:引产时留取羊水或胎儿血,采用原位法进行羊水或血细胞培养及染色体核型分析。2 .FGFR3基因热点突变的检测:DNA提取：引产时留取羊水或胎儿血,
6、采用微量血及羊水提取DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取羊水或胎儿血DNA,依照说明书进行。同时留取胎儿双亲的静脉血才是取DNAo(2)10例胎儿均进行了FGFR3基因(OMlM:*134934;UCSC:NMoOol42)热点突变区域的检测。热点突变位于c.1138位点,利用Primer3软件自行设计引物,片段长度519bp,由上海英俊公司合成。上游引物序歹U:5-CCTeTAGAcTCACTGGCGTTAe-3下游弓|物序歹U:5-Gtaccctaggctctacatggtg-B,o聚合酶链反应(POIymeraSeChainreaCtion,PCR):采用降落PCR(touchd
7、ownPCR)o95变性5min,前14个循环为95oC30sz63-56oC30sz每个循环递减0.5,72OC延伸30s;之后9530s,5630sz72OC延伸30s,共21个循环,最后延伸7mino(4)PCR产物序列测定:PCR产物纯化后测序，发现突变后重复测定确认。染色体及FGFR3基因检测异常胎儿的双亲进行基因相同部位的PCR及测序。病例3胎儿颅骨骨化差,因此考虑软骨生成不全1,进行了FGFR3基因全部外显子及SLC26A2,Trip11基因外显子测序。结果一、胎儿染色体及尸体解剖结果10例胎儿均成功进行了染色体核型分析,9例核型正常,1例(病例6)为嵌合体,核型为46zXY45
8、,XY,-18。尸体解剖结果均符合临床短肢畸形的诊断但未就具体类型做出诊断。二、FGFR3基因热点突变区域检测结果10例胎儿均进行了FGFR3基因热点突变区域的检测,直接测序发现4例(例1、2、7及10)存在基因突变。例1为c.1108GT突变,引起第370位氨基酸由甘氨酸变为半胱氨酸(G370C)(图1),胎儿双亲DNA测序结果未见异常。可见胎儿为新生突变。结合超声检查及出生后检查,明确诊断为致死性骨发育不良。例2、7、10检测发现cJ138GA突变,引起第380位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸(G380R)(图2),胎儿双亲发育均正常且DNA测序未见异常,胎儿明确诊断为软骨发育不全。图片此4例胎
9、儿的基因突变均为新生突变,再发风险低,目前其中3例胎儿母亲已再次妊娠分娩,新生儿均无异常。病例3胎儿FGFR3基因全部外显子及SLC26A2sTripl1基因检测均未发现致病突变。讨论胎儿骨骼畸形多达370种,是胎儿常见的畸形之一,妊娠期超声检查可以发现90%以上的骨骼畸形但诊断准确率仅40%2,5-6。引产胎儿的X线检查、尸体解剖及骨和软骨的组织学检查有利于明确诊断,但在目前我国实际临床工作中,对引产的死胎进行X线检查多用于科学研究,且缺乏专业的放射学专家对结果进行判读,普通尸体解剖也往往仅测量肢体长度,不能提供更多信息。本组10例以短肢畸形为主要表现的病例,临床诊断均来源于产前超声检查结果
10、,仅为表型描述,因此很难为患儿家庭提供可靠的遗传咨询。目前常见胎儿骨骼畸形的致病基因已明确,如致死性骨发育不良、软骨发育不全致病基因为FGFR3成骨不全II型致病基因为C0L1A1和COL1A2o而软骨生成不全分I型和!型,工型为常染色体隐性遗传,Ia型致病基因为Tripl17lIb型致病基因为SLC26A2;!型为常染色体显性遗传,致病基因为CoL2A11,3。致病基因筛查有助于明确诊断。本组10例病例进行了FGFR3基因热点突变的检测。FGFR3基因位于4号染色体,1994年被成功克隆8-9。与FGFR3基因突变有关的遗传性骨骼疾病有软骨发育不全、致死性骨发育不良、软骨发育低下、严重软骨发
11、育不良合并发育迟缓及黑棘皮症等。FGFR3基因突变位点不同,引起的疾病亦不同10。99%的软骨发育不全由FGFR3基因c.1138GA（G380R）突变引起（小部分为c.1138GC突变）,该突变位于跨膜区,为常染色体显性遗传。软骨发育不全是妊娠晚期常见的胎儿短肢畸形,本组10例中,妊娠晚期5例,其中3例为软骨发育不全。因此,若妊娠中期超声检查胎儿未见异常,而在妊娠晚期出现胎儿肢体明显短小,应考虑软骨发育不全。软骨发育不全80%以上为散发病例,研究认为可能与父亲高龄（35岁）有关口1L但此3例夫妇均非高龄。致死性骨发育不良在超声图像上最明显的异常是长骨极短、弯曲,呈电话筒状改变,尤以股骨及肱骨
12、更为明显;其他超声图像改变还有胸腔狭小、三叶草状头白页、前额突出和大头等。由于胸腔狭小,肺发育不良新生儿出生后很快死亡。根据是否伴有头颅畸形,致死性骨发育不良分为2型。I型:严重短肢、长骨弯曲、窄胸、肋骨短、腹膨隆。11型合并有三叶草形头颅、短肢、长骨弯曲及椎骨扁平。本研究病例1胎儿临床表现与I型相符,对FGFR3基因热点突变区域测序证实为G370C突变,证实了致死性骨发育不良的诊断。目前,只检索到美国和日本各有1例FGFR3G370C突变的报道,均在致死性骨发育不良患者中检出。可能的致病机制为G370C突变使FGFR3受体在接近细胞膜外区域产生一不配对的半胱氨酸残基,可能导致在2个突变的单体间形成分子间二硫键并激活,从而引起FGFR3基因功能的改变12-13。总之,通过相关基因检测可明确部分短肢畸形病例的致畸原因,避免妊娠晚期引产面临的伦理学困境。但是,涉及骨骼畸形的基因多达140种,对某一个体提供个性化的基因诊断非常困难,本研究对病例3进行了FGFR3基因全部外显子及SLC26A2zTrip11基因检测,但未发现致病基因。不过,相信随着新一代测序技术的应用,将有助于骨骼畸形的基因筛查的实施。
