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1、人皮肤成纤维细胞库的构建试剂：胶原酶(Sigma),优质胎牛血清(GibCo),胰蛋白酶(Sigma),中性蛋白酶(Sigma),DMEM培养基(Sigma),二甲基亚碉(MerCk)O配液:成纤维细胞培养基配制:DMEM1.Og,NaHC033.7g,HEPES2.4g,优质胎牛血清IOOn1.1,青霉素IOoOoOU,链霉素IOoOOOU,超纯水加至IoOOm1,用INNaOH调PH值至7-27.4,0.22Pan孑1.滤膜过滤除菌，90m/瓶分装，一20贮存备用。D-Hanks平衡盐液：NaC1.8.0g,KC1.0.4g,Na2HPO412H：0134.4mg,KHP040.06g,N
2、aHC030.35g,酚红0.02g,青霉素IO(X)OOU,链霉素IooooOU,超纯水加至1OOorn1,用INNaoH调PH值至7.2-7A,0.22tun孔滤膜过滤除菌，90m1./瓶分装，一20C贮存备用。方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D-Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成03cmx2.Oem大小的皮条，置于培养皿中，加0.25%胰蛋白酶浸没组织，4C冰箱中消化1416h,以用眼科镣能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋
3、白酶消化作用；用眼科镜轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0.1CmXo.1CmX0.1cm),加入0.2%胶原酶浸没组织，37。C孵箱中消化1.4h,以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；力IW-HankS平衡盐液1500#Inin离心5min,5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，力口DMEM制成细胞混悬液，接种至50In1.培养瓶中，置37C、5%C0：、湿度95%的CO孵箱中培养131。24h后更换培养基，以后更换培养液1次/3d,大约79d左右长满后传代。成纤维细胞的传代:倒掉培养瓶内旧培养液
4、，向培养瓶内加入025%的胰蛋白酶2m1.。轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后倒掉消化液后再加入2nd新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。消化约2-5min后把培养瓶放置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM2m1.终止消化，用吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。按1.3传代至新的培养瓶中，置.37。C、5%C0、湿度95%的C02孵箱中培养，约35d左右可再次传代。成纤维细胞的冻存与复苏:用025%的胰蛋白酶2m1.消化、分散接近长满单层的成纤维细胞，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DM
5、EM6m1.终止消化，轻轻吹打细胞。以使细胞游离，1500r/min离心5min,去除胰蛋白酶及旧的培养液，将细胞重悬于配制好的含有10%无菌二甲基亚碉DMEM冻存液中，然后分装入无菌塑料冻存管中，每支冻存管加液1.2m1.,封闭冻存管，标明细胞的名称、代数及冻存Id期，先将冻存管置于4C冰箱中保存2h,-20C冰柜中保存2h,-80超低温冰柜中保存2h,即可迅速投入一196C长期保存。复苏时，将冻存管从液氮中取出，迅速置于37C水浴中复温，加入8m1.培养液，混合后1OoOrmin离心5min,倾去上清液，再加入Iorn1.培养混悬，重复低速离心5rain,以除去二甲基亚碉，用新鲜培养液重悬
6、细胞，用培养液适当稀释，使细胞接种密度为IX1.1.Y/m1.,接种培养瓶，置37C、5%CO、湿度95%的CO培养箱内培养，待细胞贴壁后更换培养液。最后，将成纤维细胞在倒置显微镜下直接观察其细胞形态，并摄相。换液注意事项：贴壁细胞换液的时候是从培养瓶的非细胞附着面加PBS(避免影响细胞贴壁)，然后轻轻晃动瓶子，从非细胞附着面倒出PBS(也可以吸出来，以免弄湿瓶口)，洗的次数以镜下视野比较干净为准(只要你加PbS不是太少，一般2次左右就洗干净了)，一般不需要吹打，尤其是在你刚传了代或者细胞贴壁能力不是很好的情况下细胞的换液(1)从培养箱中取出培养瓶，观察细胞。内容有：培养瓶中培养液的PH值。培养瓶中液体是否澄清。倒置显微镜下细胞的生长状态。(2)翻转培养瓶，使贴有细胞的一面瓶壁向上，并使培养瓶口斜向上倾斜约45,开瓶盖，用酒精灯的外焰烧瓶口消毒。玻璃瓶瓶口先有雾气生成，等瓶口再次透亮即可。一次性使用的培养瓶只需将瓶口过火即可。(3)长滴管吸取培养液，放入废液缸中。(4)新吸管吸5nd培养液加入细胞瓶。(5)关瓶盖。瓶盖拧紧后向回拧半圈，以利于C02进入。完成实验记录。
