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1、18甘草次酸衍生物对smmc-7721的影响Effects of 18-glycyrrhetinic Acid Derivatives in SMMC-7721 cells 摘要：目的：研究18-甘草次酸衍生物对SMMC-7721、细胞增殖的影响。方法：利用细胞计数法，倒置显微镜法，MTT法，oecHhst-33258染色法，流式细胞仪检测法，观察和研究经不同浓度18-甘草次酸衍物作用24h，48h和72h的肝癌细胞SMMC-7721的形态结构，生长抑制率,细胞凋亡的变化，并探究了对SMMC-7721影响的最适18-甘草次酸衍物的浓度。结论：经不同浓度的18-甘草次酸衍物作用后的SMMC-77
2、21，经显微镜观察显示:细胞的形态发生改变，出现膨胀或皱缩现象；通过MTT检测表明细胞的增殖抑制率随18-甘草次酸衍物浓度的增加而增加，随着作用时间的增长而增加，通过，Hoechst-33258试剂盒染色法研究表明18-甘草次酸衍物还可影响细胞的凋亡。关键词：18-甘草次酸衍物SMMC-7721 细胞增殖 细胞凋亡 细胞形态Effects of 18-glycyrrhetinic Acid Derivatives in SMMC-7721 cells Abstract: Purpose: Study the 18-glycyrrhetinic Acid Derivatives to cance
3、r of the liver the influence of cells. Methods: Using the method of microscopic to inverted microscope, MTT method, Hoechst-33258 Staining Kit. In order to observations and research the 18-glycyrrhetinic Acid Derivatives training 24 h, 48 h and 72h of liver cancer cells SMMC-7721 the morphological s
4、tructure, growth inhibition rate and the change of the cell apoptosis. And we will explore the effect of SMMC-7721 on the most suitable 18-glycyrrhetinic acid derivative of concentration. Conclusion: the18-glycyrrhetinic acid derivative cultured SMMC-7721, the microscope observation showed that: cel
5、l morphological changes, swelling or shrinkage phenomenon; detected by MTT showed that the inhibition rate of cell proliferation with the increase of 18 - glycyrrhetinic acid derivative concentration increases with time, with the growth of increase, through, Hoechst-33258 kit staining showed that 18
6、-glycyrrhetinic acid derivative can also influencecellapoptosis Keywords:18 - glycyrrhetinic acid derivative SMMC-7721 cells proliferation and apoptosi目录前 言21.实验用品51.1仪器51.2试剂52.试验方法52.11640培养基的配置52.1.1过滤器的准备和安装52.1.21640培养基的配置52.2细胞复苏62.3细胞传代62.4细胞冻存7 2.5 利用MTT法检测18-甘草次酸衍生物对肝癌细胞的抑制率72.5.1试剂配制82.5.2
7、细胞计数82.5.3利用MTT法检测18-甘草次酸衍生物对肝癌细胞的抑制率82.6用18-甘草次酸衍生物作用肝癌细胞后进行显微镜观察92.7利用Hoechst-33258细胞凋亡染色试剂盒检测细胞凋亡情况93.结果与分析103.218-甘草次酸衍生物对肝癌细胞形态结构的影响133.318-甘草次酸的衍生物对肝癌细胞凋亡的影响134.结论14参考文献14 前 言豆科植物甘草( Glycyrrhiza uralensis Fisch) 光果甘草、胀果甘草干燥根和根茎。性平,味甘。能补脾益气,清热解毒,止咳祛痰、缓急定痛、调和诸药等功效。有“阁老”之称,解百毒的作用。现代研究含主要成分有三萜类化合物
8、(甘草甜素亦甘草酸盐,甘草酸等) ,黄酮类化合物(甘草黄碱酮,异甘草黄铜,甘草素等) 及甘草多糖类化合物等三大类。现代药理学研究表明,甘草具有保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、镇咳、抗疟,抗氧化、抗癌、免疫调解、降糖和抗血小板凝集等多种活性1。 甘草的主要成分甘草酸及甘草次酸，有诸多药理作用。第一、甘草次酸和甘草酸对消化系统有作用，可治疗上消化道溃疡，抑制胃酸分泌，当肠管处于痉挛状态时,则有明显的解痉作用。2-3第二、具有抗炎作用，研究认为甘草次酸对大鼠棉球肉芽肿、甲醛性浮肿、结核菌素反应、皮下肉芽肿性炎症均有一定的抑制作用. 将它试用于各种皮肤病的治疗,通过许多临床试验,确证了其抗炎的有效性. 如3
9、2氨基2112脱氧甘草次酸对各类动物的无菌性关节炎表现出明显的抗炎活性. 甘草次酸衍生物的抗炎作用与其对蛋白激酶的影响有关,其机制可能与它们能和蛋白激酶结合,进而抑制蛋白激酶与ATP结合,最终抑制了多肽磷酸化反应有关 4-5 .第三，具有抗病毒作用，甘草酸类化合物通过对多种病毒颗粒的直接作用和诱生干扰素,增强天然杀伤细胞和巨噬细胞的活性等活化宿主免疫功能的间接作用,而发挥广谱病毒作用。是一种有发展前景的抗病毒药物6。第四、具有抗菌作用，甘草的醇提取物及甘草酸钠在体外对金黄色葡萄球菌,结核杆菌,大肠杆菌,阿米巴原虫均有抑制作用7。第五、国外文献曾经报道甘草次酸钠有降低胆固醇,B- 脂蛋白及甘油三
10、酯水平, 有抗动脉粥样硬化的作用。为了开辟调血脂用途, 孟富敏等人通过实验观察甘草次酸钠对正常动物血脂的影响 。实验结果表明甘草次酸钠可使动物血脂明显降低, 尤以甘油三酯,B- 脂蛋白为甚, 但是胆固醇降低在用药前后无显著差异。从结果来看,孟富敏等人认为甘草次酸钠有希望作为降血脂药，值得进一步研究8。 第六、日本学者熊谷朗研究证明甘草甙有破坏血管内爱滋病毒的作用, Hatano也报导了甘草具有抗爱滋病毒的作用,这是一个好的开端,作为甘草的主要成分甘草次酸及其衍生物,其中有可能会成为治疗爱滋病的新药2 .第七、甘草次酸具有抗2萘基异硫氰酸盐诱导的肝损伤作用具有肝脏保护作用9 ,对注射CCl4导致
11、的肝纤维化有一定的缓解作用,可用于治疗肝纤维化10。第八、有报道甘草次酸100mg/kg给豚鼠肌肉注射, 10 min后,其短声引起的耳蜗微音电位和听神经动作电位振幅增大,听神经动作电位反应阈值降低,这一实验表明表明甘草次酸具有提高豚鼠内耳听觉功能的作用,有可能是其直接作用内耳的结果11。 但是, 临床上大量使用该类药物时常伴有类醛固酮多症(Pseu2doaldoster onism) , 其特征是钠潴留、钾排泄量增加, 引起水肿、高血压、低血钾等一系列的副作用。另外, 也有报道甘草次酸能引起动物甲状腺中度抑制, 有降低基础代谢率的作用1 4, 52。而且水溶性差以及高浓度时对正常细胞的毒性制
12、约了其在临床上的应用。为了克服或减轻这些副作用以及改善甘草次酸的溶解性、吸收性和有利于制成合适的剂型, 国内外的学者对其结构进行修饰和改造, 设计了一系列的甘草次酸衍生物1 62。并以此为依据, 为进一步寻找高效、低毒、副作用小的新药成分, 以充分发挥甘草的药用价值。 甘草次酸3 位上羟基被取代后抗炎活性、抗溃疡活性较为显著。 甘草次酸3 位、30 位分别或同时成酯, 其衍生物具有较高的抗炎活性。甘草次酸30 位成酰胺后具有较理想抗胃溃疡活性。甘草次酸的不良反应主要是因为11- 位羰基的存在, 11- 位羰基脱去后不但可以消除或减弱其副作用, 增强药理活性而且有表现出强的抗溃疡、抗变态及抗炎活
13、性。对甘草次酸同时或分别于23、28 位上一个羟基后, 形成的衍生物显示出显著的抗肿瘤增生活性12。杨晓辉等根据甘草次酸的构效关系, 以甘草次酸为原料, 合成了氨基酸类化合物或咪唑杂环类化合物与甘草次酸结构单元构筑的N - 乙酰氨基乙酸甘草次酸酯( ) 3、N -乙酰- DL- A- 氨基丙酸甘草次酸酯( )、N - 乙酰- DL- 蛋氨酸甘草次酸酯( )、咪唑- 4 - 羧酸- 5- 甘草次酸酯( ) 和咪唑- 4 - 羧酸- 5 -( 11- 脱氧甘草次酸)酯( )等5种甘草次酸3位酯类衍生物, 并以波谱数据确定其结构, 以二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型评价其抗炎活性。结果表明,所合成的甘草次
14、酸3位酯类衍生物对二甲苯致耳肿胀具有明显的抑制作用, 其抗炎活性与氢化可的松相近, 且化合物、的抗炎活性还高于氢化可的松13。而哌嗪环是药物化学研究中常用的一类碱性基团，其毒性小，易形成多个氢键或离子键，常能有效地调节药物的脂水分配系数和酸碱平衡常数。将其引入分子，能有效地增加分子的碱性和水溶性，从而增强分子的活性。因此，在一定程度上，哌嗪基团是一个增效基团，常在许多药物的设计和开发中引入。研究表明，含哌嗪且N-取代的化合物常显示出广泛的生物活性，如抗微生物、抗高血压、抗癌、消炎和止痛等14。本文主要对宁夏大学化工学院研制的含哌嗪环的甘草次酸衍生物是否具有抑制肝癌细胞的作用进行研究。利用细胞计
15、数法，倒置显微镜法，MTT法，oecHhst-33258染色法，流式细胞法观察和研究经不同浓度18-甘草次酸衍物作用24h，48h和72h的肝癌细胞SMMC-7721的形态结构，生长抑制率,细胞凋亡的变化，并探究了对SMMC-7721影响的最适18-甘草次酸衍物的浓度。研究发现经不同浓度的18-甘草次酸衍物作用后的SMMC-7721，经显微镜观察显示:细胞的形态发生改变，出现膨胀或皱缩现象；通过MTT检测表明细胞的增殖抑制率随18-甘草次酸衍物浓度的增加而增加，随着作用时间的增长而增加，通过，Hoechst-33258试剂盒染 色法研究表明18-甘草次酸衍物还可影响细胞的凋亡。1.实验用品1.1仪器 4冰箱、液氮罐、离心机、微量移液器、冻存管、离心管、倒置显微镜、CO2培养箱、超净工作台、培养皿、废液缸、血细胞计数板、96孔板、酶标仪、荧光显微镜、6孔板、盖玻片、载玻片、过滤器1.2试剂1640培养基、青霉素、链霉素、0.25胰酶、小牛血清、DMSO溶液、0.9NaCl溶液、MTT溶液、75乙醇2.试验方法2.11640培养基的配置2.1.1过滤器
