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1、常见常见可食用坚果的抗氧可食用坚果的抗氧化和抗增殖活性化和抗增殖活性目录目录一、研究进展一、研究进展二、研究目的二、研究目的三、研究内容三、研究内容四、实验内容四、实验内容五、实验总结五、实验总结六、展望六、展望一、研究进展一、研究进展坚果是不饱和脂肪酸，蛋白质，纤维，微量营坚果是不饱和脂肪酸，蛋白质，纤维，微量营养素，维生素，和植物化学物质丰富的来源，养素，维生素，和植物化学物质丰富的来源，不同的坚果含量水平不同。不同的坚果含量水平不同。坚果是植物化学物质的一个很好的来源的，包坚果是植物化学物质的一个很好的来源的，包括酚类（丹宁酸，鞣花酸，和姜黄素），黄酮括酚类（丹宁酸，鞣花酸，和姜黄素），
2、黄酮（木犀草素，槲皮素，杨梅素，山柰酚，和白（木犀草素，槲皮素，杨梅素，山柰酚，和白藜芦醇），大豆异黄酮（木黄酮和大豆黄酮），藜芦醇），大豆异黄酮（木黄酮和大豆黄酮），萜类化合物和维生素萜类化合物和维生素E E。一、研究进展一、研究进展坚果对人类健康的作用：坚果对人类健康的作用：1 1、有利的脂肪酸：、有利的脂肪酸：A-A-亚麻酸抗心律失常，饱和亚麻酸抗心律失常，饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸有利于葡萄糖和胰岛脂肪酸和多不饱和脂肪酸有利于葡萄糖和胰岛素动态平衡素动态平衡2 2、抗氧化活性、抗氧化活性3 3、修复、修复DNADNA损伤损伤4 4、减少肿瘤的引发或促进细胞的调控分化和增、减少肿瘤的引发
3、或促进细胞的调控分化和增 殖殖5 5、免疫学活性的调控和炎症反应的调节、免疫学活性的调控和炎症反应的调节二、研究目的二、研究目的坚果中成分的潜在作用机制可能是在对癌症的坚果中成分的潜在作用机制可能是在对癌症的预防还没有完全被研究出来。预防还没有完全被研究出来。到目前为止，关于坚果的研究被大部分重点放到目前为止，关于坚果的研究被大部分重点放到了脂质方面。到了脂质方面。很少的研究被集中到了坚果的植物化学物质上，很少的研究被集中到了坚果的植物化学物质上，甚至很少注意到坚果的抗氧化性和抗增殖活性。甚至很少注意到坚果的抗氧化性和抗增殖活性。三、研究内容三、研究内容（1 1）确定总酚的形态，包括坚果中可溶
4、性游）确定总酚的形态，包括坚果中可溶性游离酚和结合酚离酚和结合酚（2 2）测定总抗氧化活性）测定总抗氧化活性（3 3）评价坚果的抗增殖活性对人类肝癌和结）评价坚果的抗增殖活性对人类肝癌和结肠癌细胞的作用肠癌细胞的作用（4 4）探讨抗氧化性或抗增殖活性和总酚和类）探讨抗氧化性或抗增殖活性和总酚和类黄酮含量的相关性黄酮含量的相关性四、实验内容材料：（材料：（+）-儿茶素，亚硝酸钠，福林儿茶素，亚硝酸钠，福林-乔乔卡梯奥试剂（卡梯奥试剂（FCRFCR），），盐酸，胰高血糖素，盐酸，胰高血糖素，氢化可的松，胰岛素，和氢化可的松，胰岛素，和KMBAKMBA，氯化铝，氢，氯化铝，氢氧化钠，甲醇和丙酮，没食
5、子酸，氧化钠，甲醇和丙酮，没食子酸，2,20-2,20-偶偶氮氮-异丁基脒（异丁基脒（ABAPABAP）九常食用坚果九常食用坚果(杏仁、巴西坚果、腰果、榛子、杏仁、巴西坚果、腰果、榛子、澳洲坚果、山核桃、松子、开心果和胡桃澳洲坚果、山核桃、松子、开心果和胡桃)和花生和花生提取流程图提取流程图方法方法1 1、游离水溶性植物化合物的提取、游离水溶性植物化合物的提取 25g25g坚果坚果+200g+200g 80%80%预冻丙酮（预冻丙酮（1:81:8 w/w w/w）混匀搅拌混匀搅拌5 5m minin均质均质5 5m minin抽滤抽滤4545浓缩浓缩5050%甲醇甲醇/水水50mL50mL正己
6、烷除脂正己烷除脂离心离心1010m minin去正己烷层去正己烷层除脂两次除脂两次4545浓缩浓缩超纯水定容至超纯水定容至10mL10mL分装至分装至2mL2mL离心管离心管-40-40储存备用。储存备用。方法方法2 2、植物化学物质结合物的提取、植物化学物质结合物的提取 取取10g10g残渣残渣充氮除氧，密封充氮除氧，密封 40mL4mol/L NaOH 40mL4mol/L NaOH消化消化1h1h浓盐酸中和至中性浓盐酸中和至中性取取10mL10mL溶液溶液过硅胶柱（过硅胶柱（1:2 1:2 v/wv/w）200mL 20%200mL 20%甲醇甲醇/乙酸乙酯洗脱乙酸乙酯洗脱洗脱液在洗脱液
7、在4545浓缩至干浓缩至干超纯水定容至超纯水定容至10mL10mL分装至分装至2mL2mL离心管离心管-4040储存备用。储存备用。方法方法3 3、总酚含量测定：、总酚含量测定：Folin-CiocalteuFolin-Ciocalteu比色法比色法 所有提取物与蒸馏水以比例所有提取物与蒸馏水以比例1:101:10稀释（制定没食子酸稀释（制定没食子酸0.0-0.0-800.0mg/mL800.0mg/mL标准曲线）标准曲线）Folin-CiocalteuFolin-Ciocalteu试剂氧化试剂氧化碳酸钠中和碳酸钠中和 常温下反应常温下反应90min90min后后 760nm760nm测吸光度
8、，测吸光度，与已知的没食子酸标准曲线比较。与已知的没食子酸标准曲线比较。方法方法4、总黄酮含量的测定总黄酮含量的测定 取取0.25mL0.25mL的提取物稀释的提取物稀释1010倍倍0.075mL0.075mL 5%5%亚硝酸钠反应亚硝酸钠反应5 5m minin0.15mL10%0.15mL10%氯化铝反应氯化铝反应6min6min 0.5mL1mol/L0.5mL1mol/L氢氧化氢氧化钠钠加蒸馏水至加蒸馏水至3mL3mL在在510nm510nm用用MRX II DynexMRX II Dynex分光光度分光光度计测定该混合物的吸光度计测定该混合物的吸光度 黄酮的含量通过儿茶素标准曲线比较
9、得到，平行测定三次，黄酮的含量通过儿茶素标准曲线比较得到，平行测定三次，结果用（每一百克坚果中儿茶素当量）结果用（每一百克坚果中儿茶素当量）标准差表示。标准差表示。TOSC法：总氧自由基清除能力检测法5 5、总抗氧化能力的测定、总抗氧化能力的测定TOSCTOSC原理：原理：ABAP ABAP产生的自由基与产生的自由基与KMBA(-KMBA(-ketoketo-methiolbutyricmethiolbutyricacid)acid)作用可氧化产生乙烯作用可氧化产生乙烯,抗氧化剂的存在可与抗氧化剂的存在可与KMBAKMBA竞争结合自由基竞争结合自由基,从而减少乙烯从而减少乙烯 的产量的产量,最
10、后通过乙烯的减少程最后通过乙烯的减少程度来衡量抗氧化能度来衡量抗氧化能 力的强弱力的强弱。MTS比色法6 6、提取物抑制、提取物抑制HepGHepG2 2和和Caco-2Caco-2细胞的测试细胞的测试 用用HepGHepG2 2 和和 Caco-2 Caco-2癌细胞模型来评价坚果提取癌细胞模型来评价坚果提取物的抗增殖活性。物的抗增殖活性。抗癌症细胞增殖活性是用抗癌症细胞增殖活性是用MTSMTS比色实验来测定比色实验来测定的。的。HepGHepG2 2细胞在细胞在Williams medium EWilliams medium E上培养，上培养，Caco-Caco-2 2细胞在细胞在DMEM
11、DMEM上培养上培养 五、实验总结五、实验总结酚含量的比较酚含量的比较胡桃含有最高可溶性游离酚含量，胡桃含有最高可溶性游离酚含量，依次是山核桃，花生，开心果，腰依次是山核桃，花生，开心果，腰果，果，杏仁，巴西坚果，松子和澳洲杏仁，巴西坚果，松子和澳洲坚果，榛子。坚果，榛子。胡桃和榛子含量之间有胡桃和榛子含量之间有5959倍的倍的差差距。距。澳洲坚果是结合酚类化合物含量最澳洲坚果是结合酚类化合物含量最高的，其次是花生，榛子，胡桃，高的，其次是花生，榛子，胡桃，山核桃，开心果，腰果，杏仁，巴山核桃，开心果，腰果，杏仁，巴西坚果，松子。西坚果，松子。澳洲坚果和最的松子含量之间有澳洲坚果和最的松子含量
12、之间有4 4倍的差异倍的差异2024-4-26黄酮含量的比较黄酮含量的比较2024-4-26山核桃含有最高的可溶性山核桃含有最高的可溶性游离黄酮量，其次是胡桃，游离黄酮量，其次是胡桃，花生，开心果，腰果，杏花生，开心果，腰果，杏仁，巴西坚果，榛子，松仁，巴西坚果，榛子，松子，和澳洲坚果子，和澳洲坚果。胡桃含有最高的结合黄酮胡桃含有最高的结合黄酮量，其次是量，其次是澳洲坚果，榛澳洲坚果，榛子，巴西坚果，山核桃，子，巴西坚果，山核桃，开心果，杏仁，花生，松开心果，杏仁，花生，松子，腰果。子，腰果。抗氧化活性的比较抗氧化活性的比较胡桃有最大的抗氧化活性，胡桃有最大的抗氧化活性，其次是山核桃，花生，开
13、其次是山核桃，花生，开心果，腰果，杏仁，巴西心果，腰果，杏仁，巴西坚果，松子，澳洲坚果，坚果，松子，澳洲坚果，和榛子。和榛子。2024-4-26酚类物质的含量和总抗氧化活性之间存酚类物质的含量和总抗氧化活性之间存在正相关关系。在正相关关系。坚果中酚类及黄酮类化合物组成了具有坚果中酚类及黄酮类化合物组成了具有总抗氧化能力的部份，这表明植物化学总抗氧化能力的部份，这表明植物化学物质和其协同作用可能是造成其强大的物质和其协同作用可能是造成其强大的抗氧化活性的原因。抗氧化活性的原因。HepGHepG2 2细胞和细胞和Caco-2Caco-2细胞抗增殖活性细胞抗增殖活性2024-4-26胡桃，山核桃和花
14、生的水溶性游离提取物对细胡桃，山核桃和花生的水溶性游离提取物对细胞增殖抑制呈剂量依赖性的关系；胞增殖抑制呈剂量依赖性的关系；这这1010个样品的抗增殖活性在个样品的抗增殖活性在HepGHepG2 2细胞和细胞和Caco-Caco-2 2细胞上有所不同。细胞上有所不同。总的来说，这总的来说，这1010个样品抑制个样品抑制Caco-2Caco-2结肠癌细胞结肠癌细胞增殖比抑制肝癌增殖比抑制肝癌HepGHepG2 2细胞增殖有更大的能力。细胞增殖有更大的能力。对对HepGHepG2 2 和和Caco-2Caco-2抑制的比较抑制的比较通过坚果提取物抑制癌细胞的增殖能力能够部通过坚果提取物抑制癌细胞的
15、增殖能力能够部分地解释是由于提取物的总酚的作用，这表明分地解释是由于提取物的总酚的作用，这表明一个特殊的酚类化合物或坚果类的酚类是负责一个特殊的酚类化合物或坚果类的酚类是负责其抗增殖活性的。其抗增殖活性的。特别的酚类化合物与其他化合物在发挥抗增殖特别的酚类化合物与其他化合物在发挥抗增殖活性的作用中可能是充当相加地，协同作用地，活性的作用中可能是充当相加地，协同作用地，和和/或拮抗作用。或拮抗作用。酚类，抗氧化活性，抗增殖活性之间的关系酚类，抗氧化活性，抗增殖活性之间的关系酚类，抗氧化活性，抗增殖活性之间的关系酚类，抗氧化活性，抗增殖活性之间的关系坚果总酚含量的可溶性游离酚类和总的抗氧化活性以及
16、可溶坚果总酚含量的可溶性游离酚类和总的抗氧化活性以及可溶性游离黄酮含量和总的抗氧化活性之间有直接的关系。性游离黄酮含量和总的抗氧化活性之间有直接的关系。用可溶性游离酚用可溶性游离酚/黄酮含量和中值有效剂量（黄酮含量和中值有效剂量（EC50EC50）与）与HepGHepG2 2和和Caco-2Caco-2细胞增殖的抑制作比较，肝癌细胞增殖的抑制和可细胞增殖的抑制作比较，肝癌细胞增殖的抑制和可溶性游离酚含量和可溶性游离黄酮含量之间存在弱相关性。溶性游离酚含量和可溶性游离黄酮含量之间存在弱相关性。在所测试的坚果总抗氧化活性和在所测试的坚果总抗氧化活性和HepGHepG2 2细胞的抗增殖活性之细胞的抗增殖活性之间没有显著线性关系。同样地，间没有显著线性关系。同样地，Caco-2Caco-2细胞增殖的抑制性和细胞增殖的抑制性和可溶性游离酚含量，可溶性游离黄酮含量，总抗氧化剂之间可溶性游离酚含量，可溶性游离黄酮含量，总抗氧化剂之间呈弱的相关性。呈弱的相关性。六、展望六、展望目前关于酚类化合物的研究都是在其理化性质上，对于人体肠道的吸收研究很少多酚类化合物在安全性评价方面研究很少图表布局有待改进20
