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1、金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验 一、生物学特性一、生物学特性 菌体形态及培养特征n革兰氏阳性球菌，直径为0.5-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。n大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌。生物学特性生物学特性 菌体形态及培养特征n大多数菌株最适生长温度30-37，最适pH为7.0-7.5；n兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；n可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。生物学特性生物学特性 菌体形态及培养特征n所有的毒株产生
2、血浆凝固酶血浆凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。n金黄色葡萄球菌产生磷脂酶磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。生物学特性生物学特性 致 病 性n金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.a.溶血素溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环溶血环。b.b.杀白细胞素杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.c.血浆凝固酶血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的
3、吞噬作用。d.d.脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（DNADNA酶）酶）e.e.肠毒素肠毒素：引起急性胃肠炎。金黄色葡萄球菌是人金黄色葡萄球菌是人类类化脓感染化脓感染中最常见的病中最常见的病原菌，临床表现多种多样，原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，可引起肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全甚至败血症、脓毒症等全身感染。身感染。生物学特性生物学特性 致 病 性葡萄球菌皮肤感染生物学特性生物学特性 致 病 性n葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。n当
4、金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。二、检验程序与操作方法二、检验程序与操作方法根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准：食食 品品 卫卫 生生 微微 生生 物物 学学 检检 验验 GB 4789.10-2010 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验检样检样25g(ml)+225ml 75氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 国标：金黄色葡萄球菌检验程序血平板，Baird-parker涂片染色观察溶血血浆凝固酶试验BHI肉汤和营养琼脂小斜面36 1 血平板 18h24hrBaird
5、-parker 18h 24h 或45h 48h 36 1 18h 24h检验程序检验程序 增菌培养增菌培养n利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤（见P65）或7.5%氯化钠肉汤增菌。n置37摄氏度培养箱培养24小时。检验程序检验程序 分离培养分离培养n血平板血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环溶血环。典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环。大而突起，圆形，不透明，表面大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环光
6、滑，有溶血环血平板制作：血平板制作：成分成分：豆粉琼脂（或营养琼脂）100mL，脱纤维羊血（或兔血）5-10mL。制法制法：加热融化琼脂，冷至50，以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装灭菌试管，摆成斜面。检验程序检验程序 分离培养分离培养BP（贝尔德（贝尔德-帕克）平板帕克）平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和矿物元素丙酮酸钠丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用
7、。检验程序检验程序 分离培养分离培养n在在BP平板上典型菌落为平板上典型菌落为：灰色到黑玉色，圆形，灰色到黑玉色，圆形，光滑突起，湿润，直径光滑突起，湿润，直径2-3mm，边缘常为淡色边缘常为淡色（米黄色或灰色），周围为一混浊带周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。n长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。B-P平板检验程序检验程序 鉴定之革兰氏染色镜检鉴定之革兰氏染色镜检革兰氏阳性，球形，组成葡萄状革兰氏阳性，球形，组成葡萄状检验程序检验程序 鉴定之凝固酶试验鉴定之凝固酶试验n金黄色葡萄球菌可以产
8、生血浆凝固酶血浆凝固酶，因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。方法一：试管法方法一：试管法 挑取B-P平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，放361恒温箱培养18h24h。取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入 BHI 培养物0.2mL0.3mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落
9、到5mLBHI，361培养 18h48h，重复试验。试管法试管法阳性反应阳性反应阴性反应阴性反应不凝固少量、零散凝固明显的块状凝固巨大块凝固完全凝固，倒置不流动方法二：玻片法方法二：玻片法在一张洁净玻片中央加在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经菌悬液，若经1020s内无自凝现象发生，则加入内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆人或兔新鲜血浆1环（不用稀释），与菌悬液混合，环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果观察结果。也可按。也可按P53方法。方法。有凝块血浆均匀混浊生
10、理盐水n兔血浆制备：兔血浆制备：成分：成分：柠檬酸钠0.106 mol/L（31.3g Na3C6H5O72H2O溶于1L蒸馏水中）制法：制法：一份加兔血9份混合后离心2000rpm，10min吸取上清液即为兔血浆。25g样品样品+225ml 生理盐水生理盐水 选三个连续梯度，每个梯度分别取选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面接种之至表面干燥的干燥的BP平板（如平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板计数（分别记录每种平板计数（分别记录每种类型的菌落数）类型的菌落数）36 1 48hr 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 报告结果报告结果 金葡菌数金葡菌数/g(mL)梯度稀释梯度
11、稀释 检 样25 g(mL)样品+225 mL稀释液，均质10倍系列稀释选择3个适宜稀释度的样品匀液，各吸取 1 mL，分别接种于 3 管 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤接种Baird-Parker 平板血浆凝固酶试验36145h48 h36145 h48 h查MPN表报告结果第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数 器材准备器材准备 准备的器材准备的器材规格名称规格名称数量数量1、250ml三角瓶 1个2、10100mm试管 6支3、1ml移液管 2支4、10ml移液管 2 支5、直径为90mm平皿 8套6、250ml量筒 1支第一天第一天（一）样品处理：鱼干、腊肉（一）样品处理：鱼干、腊肉（二）增菌培养（二）增菌培养 第二天第二天 接种选择性平板进行分离培养接种选择性平板进行分离培养（一）接种选择性平板（一）接种选择性平板取增菌液取增菌液1 1环，划线接种于血平板或环，划线接种于血平板或B BP P平平板。板。（三）培养（三）培养 放于放于363611培养培养24h24h。第三天第三天 观察分离结果、镜检和观察分离结果、镜检和血血浆凝固酶试验浆凝固酶试验接种接种第四天第四天 血浆凝固酶试验（试管法）、血浆凝固酶试验（试管法）、实验报告实验报告
