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1、项目十一项目十一细胞培养细胞培养教学目标教学目标工作任务工作任务实践操作实践操作问题探究问题探究知识拓展知识拓展作作 业业教学内容教学终极目标教学终极目标会进行细胞培养会进行细胞培养会对分离的细胞进行培养会对分离的细胞进行培养会应用分离单细胞和单细胞培养的基本方法会应用分离单细胞和单细胞培养的基本方法促促 成成 目目 标标教学目标教学目标工作任务工作任务液体振荡培养愈伤组液体振荡培养愈伤组织织 任务任务3将天蓝苜蓿的种子消毒，接种到培养基上诱导无菌苗将天蓝苜蓿的种子消毒，接种到培养基上诱导无菌苗任务任务1收集单细胞，并调节细胞密度收集单细胞，并调节细胞密度 任务任务4培养单细胞使其形成愈伤组织
2、培养单细胞使其形成愈伤组织 任务任务5 切取无菌苗下胚轴，诱导愈伤组织切取无菌苗下胚轴，诱导愈伤组织 任务任务2进行愈伤组织增殖、分化培养进行愈伤组织增殖、分化培养 任务任务6分化出的小苗进行生根培养分化出的小苗进行生根培养 任务任务7项目介绍 指对从指对从植物器官植物器官或由或由愈伤组织愈伤组织上分离的单细胞（或小细上分离的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成胞团）进行培养，形成单细胞无性系单细胞无性系或或再生植株再生植株的技术。的技术。植物细胞培养Haberlandt：高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞首次进行离体细胞培养首次进行离体细胞培养小野芝麻
3、、凤眼兰的栅栏细胞小野芝麻、凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞和虎眼万年青属表皮细胞 利用植物细胞培养可以获得植物有用的利用植物细胞培养可以获得植物有用的代谢产物，也可以进行突变体的诱导和选择，还代谢产物，也可以进行突变体的诱导和选择，还可以对植物的生理生化进行研究。本项目以天蓝可以对植物的生理生化进行研究。本项目以天蓝苜蓿为材料，阐述了细胞培养的技术。苜蓿为材料，阐述了细胞培养的技术。一、天蓝苜宿愈伤组织诱导一、天蓝苜宿愈伤组织诱导 用浓硫酸浸泡种子用浓硫酸浸泡种子5min5min后，再用后，再用0.1%0.1%升汞溶液灭菌升汞溶液灭菌3min3min。无菌水冲洗。无菌水冲洗4 4次后，
4、将种子接种在不含激素次后，将种子接种在不含激素的固体的固体MSMS培养基上。种子萌发培养基上。种子萌发3 3天后切取子叶和胚天后切取子叶和胚轴。外植体切成轴。外植体切成1 12mm2mm的切段，接种在培养基上诱的切段，接种在培养基上诱导愈伤组织。愈伤组织诱导在暗培养中进行，温度导愈伤组织。愈伤组织诱导在暗培养中进行，温度为为272711。实践知识 当子叶和胚轴外植体诱导出的愈伤组织长到当子叶和胚轴外植体诱导出的愈伤组织长到5mm5mm大小时，转入液体培养基中进行旋转式振荡培养大小时，转入液体培养基中进行旋转式振荡培养(120r/min)(120r/min)。每周换液一次。每周换液一次。培养四周
5、后，用培养四周后，用400400门镍丝网过滤悬浮细胞液，门镍丝网过滤悬浮细胞液，倒置显微镜下检查和统计不同细胞系的细胞密度。倒置显微镜下检查和统计不同细胞系的细胞密度。过滤后的悬浮细胞液静置过滤后的悬浮细胞液静置1 1小时，待细胞完全沉淀小时，待细胞完全沉淀后，倒掉上清液，加入培养基将细胞悬浮液的细胞后，倒掉上清液，加入培养基将细胞悬浮液的细胞密度调到密度调到104104个个/ml/ml。二、单细胞分离和收集单细胞培养单细胞培养分离的单细胞分离的单细胞看护培养看护培养微室培养微室培养平板培养平板培养单细胞无性系单细胞无性系制备单细胞制备单细胞:细胞分离细胞分离获得单细胞的途径获得单细胞的途径由
6、完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料叶片是分离单细胞的最好材料 叶片叶片愈伤组愈伤组织织l愈伤组织或悬浮培养物愈伤组织或悬浮培养物(常常);l用用纤维素酶和果胶酸酶纤维素酶和果胶酸酶从组织分离从组织分离l机械法机械法利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术。利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术。撕去叶表皮，暴露叶肉细胞，然后用解剖刀把细胞刮下来撕去叶表皮，暴露叶肉细胞，然后用解剖刀把细胞刮下来,离体细离体细胞可直接种在液体培养基中培养。胞可直接种在液体培养基中培养。先将叶片组织轻轻研
7、碎，再通过过滤和离心将细胞纯化先将叶片组织轻轻研碎，再通过过滤和离心将细胞纯化.研钵中放入研钵中放入10g10g叶片和叶片和40ml40ml介质（介质（20mol20mol蔗糖，蔗糖，10molMgCl210molMgCl2、，、，20mol 20mol Tris-HClTris-HCl缓冲液，缓冲液，pH7.8pH7.8）轻轻研磨，然后将匀浆用两层）轻轻研磨，然后将匀浆用两层细纱布过滤，滤液经低速离心，使游离细胞沉降到试管的底部，细纱布过滤，滤液经低速离心，使游离细胞沉降到试管的底部，得到纯化的细胞。得到纯化的细胞。液体培养液体培养说明：说明：只有薄壁组织排列松散、细胞间接触面很小时，只有薄
8、壁组织排列松散、细胞间接触面很小时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。机械法用用纤维素酶和果胶酸酶纤维素酶和果胶酸酶从组织分离从组织分离利用利用纤维素酶纤维素酶果胶酶使细胞间的中胶层发生降果胶酶使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞的技术。解，分离出具有代谢活性的细胞的技术。酶解法的特点：酶解法的特点：能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护,防止细胞的胀裂。防止细胞的胀裂。液体培养液体培养酶解
9、法注意：注意：大麦、小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离。因大麦、小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离。因为叶肉细胞较长，并在许多地方收缩，细胞间有链状互锁结为叶肉细胞较长，并在许多地方收缩，细胞间有链状互锁结构阻止细胞的分离。构阻止细胞的分离。机械法和酶解法比较机械法和酶解法比较机械法：机械法：1 1、细胞不会受到酶的伤害；、细胞不会受到酶的伤害；2 2、质壁不会分离；、质壁不会分离；3 3、细胞产量低；、细胞产量低；4 4、细胞易破坏。、细胞易破坏。酶解法：酶解法：1 1、细胞会受到酶的伤害；、细胞会受到酶的伤害；2 2、质壁可能分离；、质壁可能分离；3 3、细胞产量高；、细胞产量高；4
10、4、细胞不易破坏。、细胞不易破坏。小麦悬浮悬浮振荡培养振荡培养1 1）诱导产生愈伤组织；诱导产生愈伤组织；2 2）愈伤组织反复继代，使组织不断愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；增殖，提高愈伤组织松散性；3 3）将愈伤组织在液体培养基中培养，）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物建立悬浮培养物.茎段茎段愈伤组织或悬浮培养物愈伤组织或悬浮培养物(常常)优点：优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。匀分布；有空气交流。振荡的作用：振荡的作用：对细胞团施加一定的压力，使之破碎对细胞团施加一定的压力，使之破碎成小细
11、胞团或单细胞。成小细胞团或单细胞。促进培养基和容器内空气之间气体交促进培养基和容器内空气之间气体交换，保证细胞正常代谢。换，保证细胞正常代谢。取取5ml5ml悬浮细胞液置于直径悬浮细胞液置于直径5cm5cm的玻璃培养皿的玻璃培养皿中进行静止的浅层液体培养。培养皿置于培养箱中进行静止的浅层液体培养。培养皿置于培养箱中进行暗培养，温度为中进行暗培养，温度为2727士士11。每隔。每隔1010天加入天加入2 23ml3ml新鲜培养基。当愈伤组织长到新鲜培养基。当愈伤组织长到1 12mm2mm时，时，统计每个培养皿中形成愈伤组织块的数量，并将统计每个培养皿中形成愈伤组织块的数量，并将愈伤组织转入固体培
12、养基上进行增殖。当愈伤组愈伤组织转入固体培养基上进行增殖。当愈伤组织增殖到织增殖到4 45mm5mm时，培养基上进行时，培养基上进行分化培养分化培养。三、单细胞培养单细胞培养方法单细胞培养方法看护培养法看护培养法微室培养法微室培养法固体平板培养法固体平板培养法液体浅层培养法液体浅层培养法平板培养法平板培养法 单细胞培养方法用途用途：诱导形成单细胞系。：诱导形成单细胞系。含义含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。并使其生长和增殖的方法。看护培养的含义及用途看护培养的含义及用途用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养
13、细胞用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。的一种方法。就是把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，就是把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织在愈伤组织和培养的细胞之间有一层滤纸相隔。和培养的细胞之间有一层滤纸相隔。（一）、看护培养法（1 1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。备用。（2 2）在无菌条件下，将一小块（）在无菌条件下，将一小块（1cm1cm3 3）活跃生长的愈伤组）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm1
14、cm）已已灭菌的滤纸，放置一晚上。灭菌的滤纸，放置一晚上。（3 3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。（4 4）恒温培养。）恒温培养。看护培养基本技术看护培养图示：Nurse callusFilter paperSingle cell单细胞无性系单细胞无性系恒温培养恒温培养1个月个月23月月用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织称块为其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织看护愈伤组织优点：优点：（1 1）简便易行。）简便易行。（2 2）效果好，易于成功。）效果好，易于成功。
15、缺点：缺点：（1 1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。3、看护培养特点：离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养则分离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养则分裂的原因：裂的原因：看护愈伤组织给单细胞提供了培养基的营养成分和促进看护愈伤组织给单细胞提供了培养基的营养成分和促进细胞分裂的其它活性物质。细胞分裂的其它活性物质。1 1 微室培养的含义及用途微室培养的含义及用途用途用途:主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。含义含义:将单细胞培养人工制造的一个小室中（少量的培养将单细胞培养人工制造的
16、一个小室中（少量的培养基中）进行培养。基中）进行培养。（二）、微室培养法微室培养图示：1滴含单细胞培养液滴含单细胞培养液周围加石蜡油周围加石蜡油凹穴载凹穴载玻片玻片旁边加石蜡油旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片平视图平视图置培养皿中置培养皿中2628 恒恒温培养温培养微室培养要求：微室培养要求：微室内不能有气泡。微室内不能有气泡。微室的厚度最好不要超过微室的厚度最好不要超过2020微米，微米，盖玻片的厚度要在盖玻片的厚度要在0.17-0.18mm0.17-0.18mm左右。左右。观察时要保持温度和培养时一致。观察时要保持温度和培养时一致。2 微室培养特点：优点：优点：（1 1）在培养过程中，可以连续进行显）在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程团的全部过程缺点：缺点：（1 1）培养时间较短）培养时间较短1 1、含义及用途：、含义及用途：含义含义:将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。（三）、平板培养法2
