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1、淋巴细胞亚群检测在评估成人噬血细胞综合征预后中的价值噬血细胞综合征(hemophagocyticsyndrome,HPS)是一组以淋巴细胞和组织细胞过度增殖和激活以及细胞因子风暴形成引起的多器官炎症损伤引起的综合征1,2,3,临床表现以持续性发热、肝脾及淋巴结肿大、外周血细胞减少、凝血功能障碍和肝功能异常，骨髓中巨噬细胞异常增生伴有各种血细胞吞噬现象4o其发病机制目前尚未完全明了，许多研究认为免疫功能紊乱导致的组织细胞和淋巴细胞活化增生在HPS的发生、发展过程中发挥关键作用3,5。淋巴细胞和单核吞噬细胞过度活化产生高细胞因子血症并激活巨噬细胞是导致噬血细胞综合征(hemophagocyticI
2、ymPhOhiStiOCytOSis,H1.H)患者细胞及体液免疫功能异常的主要原因6,7o此外，有研究显示在一些HPS患者中存在免疫球蛋白的异常8,9,这表明免疫球蛋白参与的体液免疫亦可能参与了HPS疾病的发生发展。目前，淋巴细胞亚群的改变及其与预后的关系在儿童HPS患者中已有部分报道10,但淋巴细胞亚群及免疫球蛋白对成人HPS患者免疫功能评估及疾病预后评估的意义尚待进一步明确。在此，本研究选取8家医院确诊的172例成人HPS患者为研究对象，回顾性分析其外周血淋巴细胞亚群、免疫球蛋白特征及纤维蛋白原等变量，并分析其与患者预后的相关性。对象与方法一、对象收集2013年1月至2020年8月8家医
3、院确诊HPS的成人(218岁)患者共计172例，其中生存组68例，中位年龄48(27,63)岁，男性患者33例。死亡组104例，中位年龄59(50,68)岁，男性患者54例。8家医院包括：徐州医科大学附属医院、济宁医学院附属医院、山东大学齐鲁医院、盐城市第一人民医院、安徽医科大学第一附属医院、淮安市第一人民医院、常州市第一人民医院和皖北煤电集团总医院。本研究通过徐州医科大学附属医院伦理委员会审批(批号:XYFY2022-K1.248-01),经伦理委员会批准,免除患者知情同意。诊断标准:HPS诊断参照国际组织细胞协会(HemophagocyticIymphohistiocytosis,H1.H
4、)-2004诊断指南11,符合以下8条中的5条即可诊断：(1)发热；(2)脾大；(3)血细胞减少，累及外周血两系或三系；(4)高甘油三酯血症和/或低纤维蛋白原血症，空腹甘油三酯23.0mmol1.,纤维蛋白原5g/1.；(5)血清铁蛋白升高(2500g1.);(6)可溶性白细胞介素-2受体(solubleinterIeukin-2receptor,sCD25)2400U/ml;(7)自然杀伤细胞(naturalkiIlercell,NK)活性降低或缺乏；(8)骨髓、脾脏或淋巴结活检有吞噬血细胞现象，无恶性肿瘤性疾病证据。纳入标准：(1)符合上述诊断标准；(2)所有病例均为初诊患者；(3)有完整
5、的临床资料和随访数据。治疗方案：172例患者中，23例患者采用了国际组织细胞协会H1.H-2004治疗方案11,27例采用了H1.H-94方案12,14例采用了CHOP(环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)/CHOP样(CHOP-like)方案，5例采用了脂质体多柔比星联合依托泊甘和大剂量甲泼尼龙(doxorubicin-etoposide-methyIprednisoIone,DEP)方案13,其余患者采用对症支持治疗。二、方法1.临床资料收集：收集患者的病因、血清铁蛋白、三酰甘油、纤维蛋白原、乳酸脱氢酶、白蛋白、血肌酊、丙氨酸氨基转移酶、血红蛋白、血小板、免疫球蛋白(immunoglob
6、ulin,Ig)A、IgM、IgG和淋巴细胞亚群等数据。并通过胸腹部CT平扫、B超定位明确患者有无肝、脾、浅表淋巴结肿大。2.淋巴细胞亚群检测：患者收治后于治疗前抽取外周静脉血2ml,肝素抗凝，将100I新鲜抗凝血标本放在样品测定管内，加荧光标记单克隆抗体，室温下孵育30min后加入溶血素，室温避光IOmin后，用磷酸缓冲盐溶液(PhOSPhatebufferedsaIine,PBS)洗细胞23次，弃上清，每管加500IPBS混匀后，采用1.SRFOrteSSa流式细胞分析仪进行检测，所用流式抗体包括分化簇45-多甲藻叶绿素蛋白-花青素5.5(CD4-peridinin-chIorophyII
7、-protein-Cy5.5,CD45-PerCP-Cy5.5)、CD3-异硫氯酸荧光素(CD3-fIuoresceiniSothiocyanate,CD3-FITC)、CD4一藻青蛋白7(CD4-phycoyanin7,PC7)、CD8-别藻青蛋白(alIophycocyanin,APC)-Cy7、CD19-APCCD16-藻红蛋白Cphycoerythrin,PE)和CD56-PE。T淋巴细胞表面标志选择为CD3、CD4和CD8;B淋巴细胞为CD19;NK细胞为CD16和CD56o3 .随访：通过查阅患者电子病历系统及纸质病史记录，确认患者住院治疗情况，对患者进行电话随访，随访时间截至20
8、21年7月。总生存期(overalIsurvival,OS)定义为患者确诊HPS到任何原因死亡或随访结束之间的时间间隔。4 .统计学分析：采用SPSSI9.0和R软件进行统计分析。对连续变量分布采用ShaPiro-WiIk检验进行正态性分析，非正态定量资料采用M(Q1,Q3)描述，非正态分布的计量资料两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，计数资料用例()表示，组间比较采用2检验。淋巴细胞亚群与免疫球蛋白的相关性采用PearSOn相关分析。对连续变量采用基于MaXStat统计量以确定其最佳截断值。预后分析采用Kaplan-Meier曲线，组间比较使用1.Og-rank检验，采用COX比例
9、风险模型进行单因素、多因素分析，P0.05为差异有统计学意义。结果一、HPS患者基线特征172例成人HPS患者中女性85例（49.4%）,中位年龄56岁。发热患者157例（90.7%）,多为持续性不规则高热，血清铁蛋白增高156例（90.7%）,肝脾肿大99例（57.6%）,丙氨酸氨基转移酶增高101例（58.7%）,乳酸脱氢酶增高161例（93.6%）,死亡104例（60.5%）,患者的基线特征见表1。存活组与死亡组患者年龄、血小板计数和白蛋白水平比较，差异有统计学意义（P500g1.(例，%)62(91.12)94(90.38)0.0310.861TGmmoV1.,(0,0)1.975(1
10、.495,2.730)1.905(1.473,2.665)-0.1140.9091.DHU1.,M(0,0)738(445,1652)642(387,1563)-0.3900.697A1.Bg1.,M(0,Q3)32.3(27.2,35.6)27.3(24.2,32.3)-3.4310.001FIBg1.,M(Q,Q3)2.45(1.39,3.73)1.76(1.07,3.22)-1.8760.061注：HPS为噬血细黜合征，P1.T为血4骸,A1.T为丙氨酸氨基甚移酶,SF为血清铁蛋白，TG为三酰B迪，1.DH为乳薮脱氢酶，A1.B为白蛋白,FlB为纤维蛋臼原二、病因及治疗方案对患者生存的影
11、响172例HPS患者的中位生存时间8.9个月（95%CI0.0024.485）,中位随访时间40.1个月（95%CI26.73853.529）,5年OS为37.4%。患者的生存概率曲线见图1o其中感染相关HPS患者83例（48%）,包含EB病毒感染44例，淋巴瘤相关HPS患者50例(29%),风湿性疾病相关者13例，病因不明者26例。KaPlan-Meier分析表明病因总体上对HPS患者预后无明显影响(2二0.856,P=O.836)。使用H1.H-94方案、H1.H-2004方案、DEP方案和CH0P/CH0P-1ike方案患者的5年OS分别为34.8%、32.9%.75.0%和64.3%(
12、64.3/100),使用不同治疗方案的患者之间总体OS差异无统计学意义(2=7.244,P=O.299)o图1H1.H患者总体生存曲线三、淋巴细胞亚群对患者生存的影响在可评估的96例患者中,CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和CD16+CD56+细胞百分率中位数分别为79.4%(71.2%87.0%)、34.5%(23.1%46.0%)、31.0%(21.0%47.0%)、7.0%(3.0%14.0%)/口6.1%(3.2%10.5%);CD4/CD8比值中位数为0.97(0.52.1)o本研究分析了患者淋巴细胞亚群中上述指标对其生存情况的影响，结果表明只有CD8+百分率对患者的组间生存
13、差异有统计学意义(X2=7.498,P=O.023):当CD8+38.3%时患者预后较好；当CD8+11.1%时患者预后最差，1年OS仅为11.1%(图2A)。通过MaXStat法确定了各淋巴细胞亚群的截断值，其中CD3,CD4和CD4/CD8的最佳截断值分别为64.90%,51.00%和2.18。根据此截断值将患者划分为2组，结果表明患者的生存组间差异有统计学意义(2=4.169,P=O.041；X2=4,316,P=O.038；29.372,P=O.002；图2B2D),低CD3+淋巴细胞、高CD4+淋巴细胞和CD4/CD8比的患者生存情况较差。当患者的CD3+淋巴细胞51%时，其3年OS
14、仅为21.6%,不同组间差异见图2o图2H1.H患者不同淋巴亚群的生存曲线（2A为CD8亚组间生存曲线；2B为CD3亚组间生存曲线；2C为CD4亚组间生存曲线；2D为CD4/CD8亚组间生存曲线）四、免疫球蛋白组间差异性及与淋巴细胞亚群相关性分析在可评估的患者中，IgG、IgA和IgM的中位数分别为10.2、1.82和0.849g1.o进一步分析CD3、CD4、CD4CD8.CD19和CD16+CD56+与IgG、IgA和IgM的相关性,结果表明CD3与IgM呈负相关（尸-0.279,P0.022）,CD8与IgG呈正相关（r=0.268,P=O.020）。五、预后分析通过MaXStat计算出患者的年龄、纤维蛋白原、白蛋白、肌酥、血小板、血红蛋白的截断值分别为50岁、196g/1.、29.9g/1.,56mol1.,110109/1.和93g1.o单因素分析表明，成人HPS的预后受多种因素的影响：IgM、CD4、CD4/CD8,年龄、纤维蛋白原、血肌酥、血小板和白蛋白（P0.05,表2）o进一步将上述变量引入CoX模型采用向前逐步法进行多因素分析，结果表明CD4/CD8、年龄、纤维蛋白原和血红
