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1、附录A钩端螺旋体病原学检查A.1临床样本显微镜检查A.1.1患者血液直接镜检A.1.1.1取早期患者血液一滴，加蒸馆水一滴，使血细胞溶解，在暗视野显微镜下检查有无活动的钩端螺旋体。A.1.1.2取早期患者静脉血Im1.2m1.于无菌试管中静置凝固，离心沉淀，吸取血清与血细胞交界处略显白色的悬液，置于载玻片上，在暗视野显微镜下检查有无活动的钩端螺旋体。A.1.1.3采集早期患者静脉血1m1.,加于含2m1.枸椽酸钠盐水管中，100Or/min离心10min,吸上层血浆置另一清洁管中，3000rmin3500r/min离心30min60min。弃上清，取沉淀物一滴于玻片上，用暗视野显微镜检查有无活
2、动的钩端螺旋体。A.1.2患者尿液直接镜检无菌采集患者尿液，取一滴尿液置于载玻片上，加盖玻片，在暗视野显微镜下检查有无活动的钩端螺旋体。A.2细菌分离培养A.2.1患者血液培养血培养应在发病最初10d内并在使用抗生素治疗前进行。无菌操作取患者血液100U1.200U1.,接种到5m1.10m1.KOrthOf或EMJH(ElIinghuasen-McCulIough-Johnson-Harris)等适宜培养基中，平行接种2管3管，在28C培养，每隔5d7Cl取培养物在暗视野显微镜下观察有无一端或两端弯曲成钩状、菌体呈现问号状、C或S形态的螺旋体生长，若有生长，可进一步开展鉴定。若未见生长，应继
3、续培养60d,仍不见生长方作阴性处理。A.2.2患者尿液培养采集发病1W后的患者中段尿30m1.50m1.于无菌离心管中，以100OOr/min离心1min,取沉渣0.5m1.接种于第一管5m1.KorthOf或EM川培养基中，混匀后吸0.5矶接种于第二管5m1.培养基中，混匀后吸0.5m1.接种于第三管5m1.培养基中。平行接种2管3管，在28C培养，每隔5d7d取培养物在暗视野显微镜下观察有无一端或两端弯曲成钩状、菌体呈现问号状、C或S形态的螺旋体生长，若有生长，可进一步开展鉴定。若未见生长，应继续培养60d,仍不见生长方作阴性处理。为提高检出率和减少污染,可在采集尿标本的前一天晚上给患者
4、口服碳酸氢钠(NaHCO3)2g4g,同时在培养基中加入100IIg/m1.-400gm1.5氟麻喀喔或1/2000的磺胺嗑噬。尿液标本应在留尿2h内完成接种。A.2.3患者脑脊液培养脑脊液培养应在发病最初10d内进行。对有脑膜刺激和其他神经系统症状的患者，腰椎穿刺获取脑脊液，取0.5m1.脑脊液接种于5m1.Korthof或EMJH培养基中，平行接种2管3管，在28培养，每隔5d7d取培养物在暗视野显微镜下观察有无一端或两端弯曲成钩状、菌体呈现问号状、C或S形态的螺旋体生长，若有生长，可进一步开展鉴定。若未见生长，应继续培养60d,仍不见生长方作阴性处理。A.2.4动物接种培养取患者血液或脑
5、脊液0.5m1.1m1.或尿液2m1.接种金黄地鼠(体重20g50g)或幼龄豚鼠(体重120g20Og)下腹两侧皮下或者腹腔，进行发病观察，一周后取心血暗视野显微镜下观察以及进行钩端螺旋体分离.A,3钩端螺旋体菌株鉴定A.3.1显微镜凝集试验(Microscopicagglutinationtest；MAT)A.3.1.1操作步骤待检菌株需提前在暗视野显微镜下检查，要求每400倍视野下不少于100条200条，运动活泼并无自凝。将我国15群15型标准菌株免疫家兔获得的诊断血清，56C水浴灭活30min后，用生理盐水以1：50开始稀释，稀释到1：6400t不同稀释度各血清群诊断血清、阳性对照（相应
6、标准菌株）及空白对照生理盐水各取50U1.加入各反应孔中。分别取待检分离株培养液50U1.加入上述稀释度血清及对照中。摇匀后37C孵育1ho取反应液及对照，放置载物玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况。凝集滴度按原血清稀释倍数X2计算。A. 3.1.2终点凝集滴度的判定以出现+凝集（即视野中50%钩端螺旋体被凝集）的群血清最高稀释度作为终点凝集滴度，确定所属血清群。A. 3.2核酸检测可疑菌株进行核酸检测，检出钩端螺旋体特异性核酸可判定为钩端螺旋体菌，见C.1和C.2。附录B（规范性）钩端螺旋体病血清学检查B. 1标本要求需采集患者急性期和恢复期双份血清进行检测。急性期血清应在首次检视患者时采取，
7、血清分离后进行第一次抗体检测。根据患者的病程（一般为3W4w）获得恢复期血清后，进行第二次抗体检测，两次间隔2W3wo采用显微镜凝集试验和酎联免疫吸附试验进行检测。B. 2显微镜凝集试验（MAT）1.1 .1抗原的选择和制备将我国15群15型钩端螺旋体标准菌株接种于Korthof或EM川等适宜培养基中，28C培养5d7d,暗视野显微镜检查，每400倍视野下不少于100条200条，运动活泼并无自凝者可作为抗原。1.2 2操作步骤患者血清56C水浴灭活30min后，用生理盐水以1:50（早期患者血清）或1：100（恢复期患者血清）和1：400两个稀释度做定性试验。稀释血清以及阳性对照、阴性对照及空
8、白对照生理盐水各取501.加入各反应孔中。分别取15个代表株钩端螺旋体的培养液50H1.加入上述稀释度血清及对照中。摇匀后37C孵育1ho取反应液及对照，放置载物玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况。若稀释血清与某一血清群钩端螺旋体抗原发生凝集，需进一步稀释该血清再与该群钩端螺旋体抗原进行显微镜凝集试验,以测定其凝集滴度，凝集滴度按原血清稀释倍数X2计算。B. 2.3终点凝集滴度的判定以出现+凝集（即视野中50%钩端螺旋体被凝集）的血清最高稀释度作为终点凝集滴度。B.3酶联免疫吸附试验（E1.ISA）可使用商品化试剂盒，按照操作说明书进行操作。附录C(规范性)钩端螺旋体核酸检测C.1聚合酶链式反应
9、(PCR)检测钩端螺旋体特异基因C. 1.1目标基因从临床标本和分离培养的菌株中检测钩端螺旋体核酸时,通常以SeCJ和/Va洌乍为目标基因，/Va礁因用来检测.致病性钩端螺旋体，SoCJ基因检测其他常见的致病性钩端螺旋体，也可选择其他特异性基因。C.1.2参考引物序列参考引物序列见表C.1。表C.1PCR用参考引物序列目标基因引物名称序列(5-3)扩增片段长度(bp)SeCYGlCTGAATCGCTGTATAAAAGT285G2GGAAAACAAATGGTCGGAAGflaBB64-IACTCTGAGACTTCTAC563B64-IITCCTTAGTCGACCTATGAC.1.3模板制备临床标
10、本和已经分离培养的菌株使用商品化基因组DNA提取试剂盒，具体操作方法按试剂盒说明进行。C.1.4PCR反应体系一次总量251.的反应体系如表C.2所示。表C.2PCR反应体系中的成分及加样量试剂体积晦和缓冲液(2X)12.51.上游引物(10umol/1.)1U1.下游引物(10mol1.)1H1.待测模板(阳性对照)3u1.51.(1u1.21.)纯水补足至251.反应设立质控参数：使用纯水作为阴性对照，用已知钩端螺旋体菌模板作为阳性对照。加样顺序：首先加入阴性对照，然后加待测模板，最后加入阳性对照。C.1.5PCR扩增95七预变性5min,1个循环；94变性60s,559退火60s,72延
11、伸90s,35个循环；最后72延伸10mineC.1.6PCR扩增产物的检测分析PCR产物各取5U1.加入1%琼脂糖凝胶的加样孔内(不含染料的IniX需要加入1M.上样缓冲液)，加入Marker51.,5V/cm电泳40min观察条带。PCR产物也可以进行测序分析。C.1.7结果判读在紫外透射仪或凝胶成像系统中观察结果，当阴性对照和阳性对照成立时，如钩端螺旋体靶基因扩增出现预期条带，则表明检测标本阳性。当阴性对照和阳性对照不成立时，需要重新进行检测。测序结果与钩端螺旋体菌特异基因序列匹配，表明标本阳性。C.2实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-TimePCR)检测钩端螺旋体特异基因C-2.1
12、目标基因从临床标本和分离培养的菌株检测钩端螺旋体时，以钩端螺旋体/6S4丽基因和力“32基因作为目标基因，也可选择其他特异性基因。C.2.2试剂选择可使用商品化试剂盒，按照操作说明书进行操作，也可按照以下步骤进行。C.2.3参考引物和探针序列16S力恸基因和力3叫因参考引物和探针序列见表C.3o表C3ReaI-TimePCR引物和探针具体信息目标基因名称序列16SrRNA1.eptoF5,-CCCGCGTCCGATTAG-31.eptoR5,-TCCTTGTGGCCGRagACAC-3,1.eptoP5,-(fam)ctcaccaaggcgacgatcggtagc-3,(bhqi)1.ip1.
13、32lip1.32-45F5,-AAGCATTACCGCTTGTGGTG-3lip1.32-286R5,-GAACTCCCATTTCAGCGATT-3,lip1.32-Prob5,-VIC-AAAGCCAGGACAAGCGCCG-3(BlIQl)C.2.4模版制备同C.1.3。C.2.5Real-TimePCR反应体系一次总量201.的RCal-TimePCR反应体系见表C.4。表C.4Real-TimePCR反应体系中的成分及加样量试剂体积断和缓冲液(2X)10H1.上游引物(10mol1.)0.4P1.下游引物(10mol1.)0.41.探针溶液(10mol1.)0.4U1.待测模板(阳性
14、对照)3H1.5u1.(1-51.)纯水补足至201.反应设立质控参数：使用纯水作为阴性对照，用已知钩端螺旋体菌模板作为阳性对照。加样顺序：首先加入阴性对照，然后加待测模板，最后加入阳性对照。C.2.6Real-TimePCR扩增一般使用两步法进行扩增，参考程序如下：95C预变性10s,1个循环；扩增反应:955s,6040s,40个循环。不同的荧光定量PCR仪扩增的程序会有一些差异，可根据所使用的仪器对反应程序进行适当调整。C.2.7结果判定当阴性对照和阳性对照成立时，16S?尤物基因和以032两个靶基因均Ct值小于35时判断为阳性，单基因或者双基因35WCt值37时结果可疑，需重新采集样本重新检测，16SrRNA基因和332两个靶基因均Ct值大于或等于37或没有峰值时判断为阴性。当阴性对照和阳性对照不成立时，需要重新进行检测。若采用商品化试剂盒，结果判断依据参照试剂盒说明书操作。
