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1、附录A（规范性）霍乱弧菌的分离与鉴定A.1标本的采集患者的粪便、呕吐物或（和）肛拭子为适宜采集的标本。水样便或呕吐物采样量般为1m1.3m1.,成形便采取指甲大小的粪量；肛拭子可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm5cm（幼儿约2Cm3cm）处旋转后取出，以看到棉拭子上沾有粪便为佳。也可采集患者日常生活物品的涂抹拭子标本和家居环境的样本。A.2标本的送检采得的标本应立即接种于培养基，不能立即接种的，应放入pH8.49.2的碱性蛋白陈水或文腊二氏保存液或插入Cary-Blail半固体保存培养基中，放置于冷藏箱内保存、送检。粪便或呕吐物等标本与运送培养基或增菌液的比例约为1:10,肛拭子应插入
2、5m1.运送培养基或增菌液中。A.3分离培养A.3.1直接分离培养对急性期患者水样便标本在进行增菌培养的同时，可取接种环或用肛拭子直接划线接种强、弱选择性平板各一个，置37C培养18h24h。A.3.2增菌分离培养标本接种于pH8.49.2的碱性蛋白陈水中置37增菌6hTh后，从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于强、弱选择性平板各一个，置37C培养18h24h。必要时可取0.1m1.一次增菌的表层培养物于5m1.的新鲜碱性蛋白陈水中进行二次增菌培养。也可选用分离效果较好的弧菌显色琼脂。A.3.3选择性培养基常用强选择性培养基包括庆大霉素琼脂、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂和四号
3、琼脂等。弱选择性培养基一般使用碱性营养琼脂等。A.3.4霍乱弧菌菌落特征A.3.4.1碱性营养琼脂霍乱弧菌在碱性营养琼脂上37C培养18h24h后为无色、圆形、透明或半透明、表面光滑、润湿、扁平或稍凸起、边缘整齐的菌落，菌落直径一般约为2mm。A.3.4.2庆大霉素琼脂和四号琼脂霍乱弧菌在庆大霉素琼脂和四号琼脂上的菌落大小和形态特征与碱性营养琼脂上的菌落特征相似,但透明性略差，多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深。A.3.4.3TCBS琼脂霍乱弧菌在TCBS琼脂上生长呈现为黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐的菌落。A.3.4.4弧菌显色琼脂霍乱弧菌在弧菌显色
4、琼脂上生长菌落呈现特征性的颜色，不同品牌的弧菌显色琼脂菌落颜色不同，具体参考厂家说明。A.4菌株鉴定A.4.1菌株初筛A.4.1.1玻片凝集试验从选择性平板上挑取疑似菌落接种于普通营养琼脂，37C培养18h24h后取纯培养物与霍乱弧菌Ol群多价血清和0139群血清做玻片凝集，进行Ol群和0139群霍乱弧菌的初筛。在1min内出现肉眼可见的明显凝集颗粒，但在生理盐水中不产生凝集者为阳性，在Imin内不出现凝集颗粒者判为凝集阴性。01群菌株应进一步用小川和稻叶血清型特异性的诊断血清做玻片凝集确定血清型别。玻片凝集试验中需要注意以下方面：a）使用的血清效价范围及结果判定参考厂家说明书；b）碱性营养琼
5、脂、庆大霉素琼脂及四号琼脂上的疑似菌落如足够大，可直接挑取疑似菌落进行玻片凝集试验。但TCBS培养基上的疑似菌落常因培养基中蔗糖的影响造成难以乳化，不宜直接进行玻片凝集试验，应挑取可疑菌落，先接种普通琼脂纯培养后再作玻片凝集；c）同一标本存在01群和0139群霍乱弧菌混合感染的可能，每份标本挑选不低于5个的疑似菌落逐一进行鉴定。干粉血清也可以配制01群和0139群混合多价进行初筛。A.4.1.2氧化酶试验用粕金环或牙签取生长在普通琼脂或其他无碳水化合物成份的非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加2滴3滴1%盐酸四甲基对苯二胺水溶液或商品化试剂，如培养物在20s内出现紫红或紫蓝
6、色，有的呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性，不显色判为阴性。A.4.1.3产毒株检测通过检测CT毒素的编码基因CH48来确认是否为产毒株，按附录B。A.4.2菌株保存和上送菌株运送和保存应符合国家有关规定。经初筛阳性或可疑阳性的菌株,在发出初步鉴定报告的同时，应尽快送当地疾病预防控制中心进行密核鉴定。复核结果符合01群或0139群霍乱弧菌产毒株的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将菌株上送省级或省级以上疾病预防控制中心（参比实验室）进行确认分析。A. 4.3菌株复核菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：革兰染色、黏丝试验、氧化酶试验、血清分型、动力试验
7、、CT毒素基因检测（按附录B）,也可选择生化鉴定条或全自动微生物生化鉴定系统。凝集反应不典型或者怀疑为彦岛型的菌株应增做试管凝集试验。菌株血清群的鉴定也可用聚合酹链式反应（PCR）方法扩增01群和0139血清群脂多糖特异性基因力来确定（按附录B）。A.5霍乱弧菌系统生化鉴定霍乱弧菌的系统生化鉴定按表A.1进行。表A.1部分弧菌科细菌的系统生化鉴定项目乱菌霍孤拟态弧菌副溶血弧菌创伤弧菌藻菌溶弧河弧菌弗尼斯弧菌海鱼弧菌霍利斯弧菌麦氏弧菌辛辛那提弧菌娑鱼弧菌最适生长温度/C373737373737372525,363725,3537氧化酶+-+黏丝实验+/-+/-+/-+硝酸盐还原+靛基质+-+/-
8、+/-+V-P试验+/-+/-+-+/-尿素酶-/+-+-赖氨酸+-+/-/+1.鸟氨酸+/-+/-1.-精氨酸-+/-葡萄糖产气-+-/+-项目乱菌霍弧拟态弧菌副溶血弧菌创伤弧菌溶藻弧菌河弧菌弗尼斯弧菌海鱼弧菌霍利斯弧菌麦氏弧菌辛辛那提弧菌鲨鱼弧菌乳糖-+/-+-麦芽糖+D-甘露醉+/-+-+-+/-蔗糖+-/+-+/-1.-阿拉伯糖-+-+-+-+-纤维二糖-+-/+-/+-+-水杨素-+-+-明月交素+-不盐陈中长验在同量水生试0%NaCl+-3%NaCl+6%NaCl+/-+/-+/-+/-+/-+8%NaCl-+-+/-+/-10%NaCl-+/-0/129敏感性IoHgSaSRSR
9、RRSRSRR150gSaSSSSSSSSSSS注：S敏感；R抗性。a部分0139群霍乱弧菌为抗性Ro附录B(规范性)霍乱诊断的相关实验技术B.1霍乱弧菌特异性核酸PCR检测8.1.1 检测靶标基因CT毒素是霍乱弧菌的主要致病因子，对其编码基因的检测可用于对霍乱弧菌产程株的确认。菌株血清群的检测也可用PCR方法扩增Ol群和0139群霍乱弧菌脂多糖特异性基因力来确定。种特异性基因位点的PCR扩增也可纳入霍乱弧菌的检测鉴定中。检测应在符合PCR检测要求的实验室中进行，实时荧光PCR方法较普通PCR操作更简便，可避免交叉污染。8.1.2 样品核酸制备8. 1.2.1粪便、呕吐物或肛拭子标本用商品化的
10、核酸提取试剂盒提取粪便、呕吐物或肛拭子标本中的细菌核酸作为PCR检测模板，标本前处理和核酸提取操作方法参照相应试剂盒说明书。B. 1.2.2疑似菌落挑取庆大霉素等选择性琼脂或普通营养琼脂等平板上的1个2个可疑菌落，以Im1.生理盐水稀释后，用核酸提取试剂盒提取DNA作为PCR检测模板。另一个替代方法是将1个2个可疑菌落于2001.纯水中煮沸IOmin,冰浴5min,100Oormin12000r/min4C离心5min,取21.31.上清液作为检测模板。B.1.2.3碱性蛋白月东水增菌培养液从增菌培养液液体表面菌膜下缘处取1m1.2m1.的培养液，10OOOiVmin12()()0r/min离
11、心3min,弃上清，沉淀用Im1.纯水重悬，用核酸提取试剂盒提取DNA作为PCR检测模板。另一个替代方法是沉淀用Im1.纯水重悬、再离心、洗涤2次后，加1001.2001.纯水重悬煮沸Iomin,冰浴5min,100OOrZmin-12000r/min4离心5min,取上清液作为检测的模板。B.1.3普通PCR检测B.1.3.1CT毒素基因检测检测CT毒素基因ar48的参照引物序列见表B.1,扩增参数：预变性94C,5min；94,30s,60,30s,72C,30s,30个循环；最后72C延伸7min。B.1.3.201/0139群霍乱弧菌脂多糖特异性rfb基因检测扩增01/0139群霍乱弧
12、菌脂多糖特异性侬基因的参照引物序列见表B.1,扩增参数：预变性94C,5min；94,30s,55,30s,72,45s,30个循环；最后72C延伸5min。B1.3.3霍乱弧菌种特异性hlyA基因检测扩增霍乱弧菌种特异性/办A基因序列的参照引物序列见表B.1,扩增参数:预变性94C,5min;94C,30s,55C,30s,72,45s,30个循环；最后72延伸5min。表B.1霍乱弧菌普通PCR检测参照引物检测基因引物名称核甘酸序列(5,-3O产物大小ZbpCtxABClxA-PlCtcagacgggatttgttaggcacg302clxA-P2TctatctctgtagcccctattacgOrfbOlrfb-PlGtttcactgaacagatggg192Olrfb-P2Ggtcatctgtaagtacaac检测基因引物名称核甘酸序列(5,-3,)产物大小Zbp0139OI39rfb-P1Agcctctttattacgggtgg449O139rfb-P2GtcaaacccgatcgtaaagghlyAhlyA-PlGcaaacagcgaaacaaatacc497hlyA-P2TccaccccaccagtcaccB.1.4实时荧光P
