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1、DBXX陕西省市地方标准DBXXTXXX-20xx狮猴桃无病毒种苗生产技术规程Technicalcodefortheproductionofvirus-freekiwifruitstock（征求意见稿）20xx-xx-xx发布20xx-xx-xx实施陕西省市场监督管理局发布前言本标准依据GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则起草。本标准由陕西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：西北农林科技大学、杨凌梦绿生态农业有限责任公司。本规程起草人：刘占德，张阿玲，史遐，刘艳飞，贺浩浩，高志雄。本标准为首次发布。I适用范围本标准规定了狒猴桃病毒脱除方法、病毒检测方法
2、、脱毒种苗保存与繁殖。本标准适用于狒猴桃脱毒种苗繁育及擀猴桃病毒检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 茎尖培养脱毒Viruseliminationbyshoottipculture切取0.20.5mm带毒试管苗茎尖，经组织培养获得无病毒植株的过程。2.2 茎尖超低温疗法脱毒Viruseliminationbyshoottipcryotherapy切取1.02.0mm带毒试管苗茎尖，经液氮处理后进行组织培养获得无病毒植株的过程。2.3 热疗法结合茎尖培养脱毒Viruseliminationbythermotherapycombinedwithshoottipculture先对带毒
3、试管苗进行热处理，热处理结束后取茎尖进行茎尖培养获得无病毒植株的过程。2.4 化疗法结合茎尖培养脱毒Viruseliminationbychemotherapycombinedwithshoottipculture先将带毒试管苗置于含抗病毒药物的培养基中培养，培养结束后取茎尖进行茎尖培养获得无病毒植株的过程。2.5 热疗法结合茎尖超低温疗法脱毒Viruseliminationbythermotherapycombinedwithshoottipcryotherapy先对带毒试管苗进行热处理，热处理结束后取茎尖进行超低温处理，最后经组织培养获得无病毒植株的过程。2.6 化疗法结合茎尖超低温疗法脱
4、毒Viruseliminationbychemotherapycombinedwithshoottipcryotherapy先将带毒试管苗置于含抗病毒药物的培养基中培养，培养结束后取茎尖进行超低温处理，最后经组织培养获得无病毒植株的过程。2.7 化疗法结合热疗法和茎尖培养脱毒ViruseliminationbychemotherapycombinedwithIhermotherapyandshoottipculture先将带毒试管苗置于含抗病毒药物的培养基中培养，之后进行热处理，热处理结束后取茎尖进行组织培养获得无病毒植株的过程。2.8 热疗法结合化疗法和茎尖超低温疗法脱毒Viruselimi
5、nationbythermotherapycombinedwithchemotherapyandshoottipcryotherapy先将带毒试管苗置于含抗病毒药物的培养基中培养，之后进行热处理，热处理结束后再取茎尖进行超低温处理，最后经组织培养获得无病毒植株的过程。2.9 无病毒母株virus-freemotherplant通过病毒脱除处理或宜接筛选获得的、经检测并确认不携带本文件规定的病毒的植株。2.10无病毒苗木virus-freeseedling未携带有本文件规定的病毒的称猴桃苗木。2.11 无病毒母本园virus-freemotherblock用于提供狒猴桃无病毒母株保存的阚地。3脱
6、毒原理病毒在植物体内分布不均匀，植物茎尖顶端分生组织中的病毒含量较低甚至不含病毒,热处理及抗病毒药物处理能够抑制病毒RNA的合成，因此可通过茎尖培养，或结合热疗及化疗对植物病毒进行脱除；在茎尖超低温疗法脱除植物病海中，茎尖经过冷冻保护处理后转入液氮中冷冻时，分化程度较低、核质比大、自由水含量较低的茎尖顶端分生组织和幼嫩叶原基细胞更容易存活。由于很多病毒无法侵入茎尖顶端分生组织，因此无病毒的顶端分生组织可以在液氮冷冻后存活并再生为无病毒植株。4病毒检测与脱除4.1 病毒种类病毒种类见表A.1包括狒猴桃病毒A(ActinidiavirusA,AcVA)物;猴桃病毒B(ActinidiavirusB
7、,AcVB)、狮猴桃种传潜隐病毒(Actinidiaseedbornelatentvirus,ASb1.V)狮猴桃黄化环斑病毒CActinidiayellowingringspotvirus,AYRSpV)A猴桃病毒1(Actinidiavirus1,AcV-I)、擀猴桃黄化病毒1(Actinidiayellowingvirus1,AcYVl)、物猴桃黄化病毒2(AClinidiayellowingvirus2,AcYV2)、苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)、樱桃卷叶病毒(Cherry1.eafRollvirus*C1.RV)、天竺葵带斑病毒(Pelarg
8、oniumzonatespotvirus,PZSV)、柑橘叶斑驳病毒(Citrusleafblotchvirus,C1.BV)等。4.2 病毒检测采用RT-PCR的方法进行病毒检测。具体参见附录Ao4.3 物猴桃无病毒母株的获取4.3.1 材料选择选择品种纯正、经观察未发现病毒病症状且生长健壮、性状优良的植株，参照4.2的方法进行病毒检测，确定不携带4.1规定的病毒的可作为无病毒母株；经检测，确定植株已感染4.1规定的病毒，则应进行脱毒处理，病毒脱除后培育的狒猴桃植株，经检测为无病毒的，也可作为无病毒母株。4.3.2 外植体的建立选取健壮狒猴桃植株当年生新梢作为外植体，剪去叶片，用自来水和洗洁
9、精溶液充分清洗干净。将枝条剪成长35cm的茎段，于超净台内用75%酒精表面消毒10305,再用1%的次氯酸钠溶液消毒510min,最后用无菌水冲洗45次。将消毒后的外植体切成长1.5Cm的带芽茎段，用无菌滤纸吸干其表面的水分后，接种至初分化培养基中，诱导茎段腋芽萌发。4周后萌发的腋芽切下，置于增殖培养基中进行继代培养，每46周继代一次。培养温度24C2C,光照强度3000Ix,光照时间16hd.433病毒的脱除4.3.3.1茎尖培养脱毒以46周苗龄的狒猴桃带毒试管苗为材料，于超净工作台中在体式显微镜下切取0.20.5mm的茎尖，将其转接至含增殖培养基的培养皿中培养，每4周继代一次。当茎尖长成小
10、植株时转至含增殖培养基的组培瓶中继续培养。43.3.2茎尖超低温疗法脱毒以46周苗龄的擀猴桃带毒试管苗为材料，于超净工作台中在体式显微镜下切取1.02.0mm的茎尖。先将茎尖置于0.25M蔗糖溶液中预培养24h；后转置于0.5M蔗糖溶液中预培养24h；预培养结束后，将茎尖转置于加载液中室温下处理20min；加载完成后,将茎尖转置于提前预冷的玻璃化冷冻保护液PVS2中冰上处理20-60min。PVS2处理结束前两分钟，将茎尖转移至灭菌铝箔条上的PVS2液滴中，后将铝箔条置于液氮中处理1ho液氮处理完毕后将带有茎尖的铝箔条从液氮中取出，迅速放入卸载液中解冻20min：卸载完成后，将茎尖转置至恢复培
11、养基中，先于242C的温度条件下黑暗培养3d,后转入正常光照下培养，每4周继代一次。茎尖超低温疗法脱除狒猴桃病毒所用溶液配方参见附录B,脱毒流程参见附录C。4.3.33热疗法结合茎尖培养脱毒以46周苗龄的物;猴桃带毒试管苗为材料，切取约2Cm大小的茎段先于正常条件下培2周，后转至热处理箱（温度：30C40C;光照强度：3000Ix；光照时间：16hd）。热处理的方式主要有三种：对于耐热品种，可采用恒温处理；中等耐热品种及热敏感品种则可采用变温处理或逐步升温处理。处理时间为24周。热处理结束后切取0.20.5mm茎尖进行茎尖培养，方法同4.331。4.3.3.4化疗法结合茎尖培养脱毒以46周苗龄
12、的梆猴桃带毒试管苗为材料，取约2Cm大小的茎段置于含15100mg/1.利巴韦林的培养基中培养46周，后取0.20.5mm茎尖进行茎尖培养，方法同4.331。433.5热疔法结合茎尖超低温疗法脱毒以46周苗龄的猫;猴桃带毒试管苗为材料，取约2cm大小的茎段先进行热处理，方法同4.333。热疗结束后切取1.02.0mm大小的茎尖进行超低温处理，方法同433.2。433.6化疗法结合茎尖超低温疗法脱毒以46周苗龄的物猴桃带揖试管苗为材料，切取约2cm大小的茎段进行化疗，方法同433.4。化疗结束后切取1.02.0mm大小的茎尖进行超低温处理，方法同4.332。43.3.7化疗法结合热疗法和茎尖培养
13、脱毒以46周苗龄的舜猴桃带毒试管苗为材料，切取约2cm大小的茎段接种至含15-100mg/1.利巴韦林的培养基中先于正常条件下培养2周，之后将其转至热处理箱继续培养24周，热疗和化疗方法同4.333和4.334。热疗和化疗结束后取0.20.5mm茎尖进行茎尖培养，方法同4.331。4.3.3.8热疗法结合化疗法和茎尖超低温疗法脱毒以46周苗龄的舜猴桃带毒试管苗为材料，取约2cm大小的茎段先进行热疗和化疗，方法同4.337。热疗和化疗结束后取1.02.0mm大小的茎尖进行超低温处理，方法同4.3.3.2o4.4 病毒脱除后茎尖再生与病毒检测经脱毒处理的茎尖培养2个月后，出现明显的茎段伸长（N5m
14、m）并再生出23片新叶时视为再生，随后将再生茎尖转接到增殖培养基上继续培养。大约培养1个月后，脱毒处理再生苗出现分株，此时将来源于同一个茎尖的植株转至同一个组培瓶中并编号，继代培养46周后取样进行第一次病毒检测。将检测结果为阴性的植株继续继代培养46周后取样进行第二次病毒检测，将两次检测结果均为阴性的试管苗初步定为脱毒苗。此后，每46周继代一次脱毒苗。4.5 生根培养以不带病毒的增殖苗为材料，切取约2cm大小的茎段转接到生根培养基(1/2MS+0.6mg1.IBA,pH=5.8),在242条件下，进行4周左右的生根培养。4.6 炼苗和移栽从生根培养至幼根长至1Cm左右时，将组培瓶移入日光温室炼
15、苗，遮阴3d不开瓶口,拧松瓶口放置Id,将瓶口敞开2d,之后进行移栽，控制气温不超过30C,空气相对湿度在90%以上。将经过炼苗的组培苗洗净培养基，移栽至基质为珍珠岩：泥炭：细沙=1:1:1或发酵饼肥：土壤：基质1:1:1并用多菌灵消毒晾干后的营养钵(口径X高为16CmXI6cm),浇透水，置于覆盖60目防虫网的温网室内，在营养钵上覆盖塑料薄膜，期间及时喷水以保持茎叶湿润，15d后揭去薄膜。4.7 无病毒苗移栽后病毒复检脱毒苗移栽半年后进行病毒复检，若复检结果为阴性，则可认定为脱毒苗；若复检结果为阳性，则该再生苗不是脱毒苗，需进行进一步的脱毒处理。此后每年至少做一次病毒复检，以防病毒再次感染。5无病毒母本园的建立5.1 圃地准备圃地所在区域应为非舜猴桃溃疡病发生区与滁猴桃适栽区。选择疏松肥沃、排水良好、微酸性的砂质壤土，且5年内未栽植过果树的地块。5.2 无病毒母株的栽植经检测确定不携带4.1规定的琳猴桃病毒，或经4.3狒猴桃病毒脱除的植株可作为无病毒母株按株行距为3mx4m定植在网室中。调查、分析并记录每单株的园艺学性状，待显示固有的园艺学性状后，选做母本树，提供无病毒接神。5.3 无病毒母本园的管理无病毒母本园常用工具须专用，枝剪、刀、锯子等在操作
