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1、ICSDB62甘肃省地方标准DB62/T-XX-2022玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程（征求意见稿）-X-XX发布-X-XX实施甘肃省市场监督管理局发布前言1 .范围12 .规范性引用文件13 .术语与定义14 .病菌接种体制备15 .抗性鉴定圃设置26 .接种27 .病情调查38 .抗性评价39 .鉴定报告4附录A培养基配方与制作方法5附录B玉米黍出芽短梗霉菌形态特征6Ux刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则规定起草。本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。本文件由甘肃省粮油作物栽培标准化技术委员会归口。本文件主要起草单位：河西学院本文件参与
2、起草单位：甘肃前进生物科技发展有限公司、金塔县农业技术推广中心、甘州区农畜产品质量检测服务中心、甘州区种子产业发展中心、甘肃德光农业有限公司、酒泉市通盈种苗有限公司本文件主要起草人：雷玉明、郑天翔、马金、李栋、冒国伟、张琪、陈海龙、吴尧、陆静、越文勤、陈晓燕本文件由河西学院负责解释。各单位或个人在执行本文件过程中如发现需要修改和补充之处，请随时将意见和建议反馈至玉米顶腐病检验鉴定技术规程编制组（地址：甘肃省张掖市甘州区北环路846号河西学院，邮政编码：734000,E-mail:Zyyndei,联系电话：13993672655）玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程1 .范围本文件规定了玉米品种北方炭疽
3、抗性鉴定技术和抗病性评价标准。本文件适用于玉米北方炭疽病接种体制备、鉴定网设置、接种、病情调查、抗性评价、菌种保存与处理、鉴定报告等的技术要求及玉米制种亲本材料、杂交种等抗性鉴定2 .规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用于本标准。本文件未引用相关标准3 .术语与定义以下术语与定义适用于本文件。3. 1玉米北方炭疽病一种由玉米黍出芽短梗霉菌引起玉米的真菌性叶部病害。3.2玉米蜀出芽短梗霉菌属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、短梗霉属的一种真菌。3.3单独分离是抱子分离的一
4、种方法。在无菌条件下，通过解剖镜或显微镜观察胞子菌悬液或琼脂平板表面，利用解剖针或移植器、玻璃毛细管等挑取单一抱子，置于相应培养基上，萌发形成菌丝而获得纯菌种的方法。3.4PDA培养基称取马铃薯200g,洗净去皮切碎，加水IOOOml煮沸20min30min,纱布过滤，补水至IOOOnn,加入葡萄糖18g20g,琼胶18g20g,搅拌均匀，120125高压灭菌301而11。3.5KZM培养基称取酸甲基纤维素10g,麦芽糖5g,蛋白陈1.5g,KH2OPO1Ig,加入IooOml蒸储水中,加热溶解，补水至IOOOm1,120C125C高压灭菌30min,3.6PD液体培养基PDA培养基中不添加琼
5、脂制作的液体培养基。3.7发病率玉米北方炭疽病发病率为受侵染叶片数占调查总叶片数的百分率表示，用以表示发病的普遍程度。采用公式(1)计算。Z(%)=df100(1)式中：/发病率；d发病叶片数；M调查总叶片数。3.8严重度1级：代表值0,2级：代表值1,3级：代表值2,病斑；4级：代表值3, 病斑；5级：代表值5, 连，病叶枯死；6级：代表值6, 叶枯死；7级：代表值7,采用分级法表示，以穗位上部和下部叶片病斑的数量和病斑面积占叶面积的百分比表示发病级别，由轻到重划分为几个级别，每个级别赋予一定代表值，以表示受害玉米叶片的严重程度。叶片上无病斑；神位下部有少量病斑，病斑占叶面积5%以下；穗位下
6、部有少量病斑，病斑占叶面积的5.1%10%,穗位上部有零星穗位下部有大量病斑，病斑占叶面积的10l%25%,穗位上部有较多穗位上部有大量病斑，病斑占叶面积的25.1%50%,穗位下部病斑相穗位上部病斑相连，病斑占叶面积的5(M%75%,穗位下部和上部病全株叶片覆盖病斑，病斑占叶面积的75.1%以上，叶片枯死。3.9病情指数是以玉米叶片北方炭疽病的发病率和叶片受侵染的严重程度数值化的综合表示指标，用以衡量玉米群体受北方炭疽病的危害程度，采用公式(2)计算。DI=(XiSi)/MSttua100(2)式中：DI病情指数；W为累加符号，从0级病级数开始累加；XL第i病级数的发病叶片数；SL第i病级数
7、的严重度代表值；M调查总叶片数；Sg为最高病级数的代表值。3.10抗性评价根据采用的技术标准判别玉米对北方炭疽病的反应程度和抵抗水平的描述。4 .田间症状鉴定参照A.1北方炭疽疽病症状特征鉴定5 .人工接种抗性鉴定5.1 病菌接种体制备5.1.1病原物分离利用组织分离法分离病原菌，将采集典型症状的病叶的病健交界处切0.2Inm0.3mmX0.2mm0.3mm小块，经75%酒精和0.1%升汞消毒，在无菌条件下接种于PDA培养基上，25黑暗培养，获得分离物。5.L2形态鉴定参照附录A.2玉米黍出芽短梗霉菌形态特征鉴定，确认为玉蜀黍出芽短梗霉菌。4.1.3分离物纯化采用单胞分离技术，在PDA培养基获
8、纯培养物。5.L4致病性测定将纯培养物在PDA平板上培养15d,刮取分生泡子用无菌水制成浓度为1IO、个mLlXIO6个mL的抱子悬浮液，喷雾接种于玉米叶片上，并保湿24h。接种IOd后观察发病情况。再从发病的组织上进行病菌再分离，获得纯培养，并与接种的菌种进行比较。5.2繁殖与保存5.2.1扩大繁殖将纯化分离物接种于PDA培养基25培养7d后活化，用灭菌内径6mm打孔器切取菌落边缘菌饼，移至KZM液体培养基中25、150rpm振荡培养3d,用于制备菌悬液。5.2.2菌悬液配制将带菌KZM液体培养基进行过滤，用血球计数板调制接种菌悬液，悬浮液中分生胞子浓度调至IXn)5个mt06个mL,加入0
9、.02%TWeen20(Wv),备用。5.2.3菌种保存待纯化菌株菌落长满培养皿时用PD洗下分生泡子，过滤后获抱子悬浮液与50%甘油1:1比例混匀，确保甘油浓度为25%,保存城-80超低温冰箱备用5.3鉴定圃设置鉴定圃可设置在田间或温室内，鉴定材料的播种时间与大田生产的播种时间相同，随机排列或顺序排列，小区行长400cm500cm,行距60Cnb株距25cm,5行区，每行保苗3035株，设3次重匏。周围设置200Cnl保护行。5.4抗性鉴定设计鉴定材料可设苗期鉴定和成株期鉴定，设对照品种为黄早四,6.抗性测定6.1接种时间苗期鉴定玉米长至67叶期接种，成株期鉴定玉米抽雄期接种。6.2接种方法依
10、据抗性鉴定设计和玉米生育期特性，接种方法应满足以下要求：a)喷雾接种，宜适合于苗期鉴定，将菌种用无菌水调制抱子悬浮液，装入小型手持喷雾器，均匀喷雾接种于植株叶片,接种量控制8ml/株IOml/株。要求抱子悬浮液在植株叶片上不流淌为宜。应选择在雨后或阴天的傍晚进行接种。接种后保湿48h,7d后调查发病情况。b）灌注接种，宜适合于成株期鉴定，用一个带刻度的IOml注射器吸取抱子悬浮液，从玉米心叶与其下的展开叶叶鞘相接处以下灌注心叶，接种量控制5ml/株6ml株。要求注射器不带针头，以心叶处冒出水珠为准。6 .3环境控制土壤肥力水平和耕作管理与大田相同，接菌时每个处理之间要进行薄膜隔离保护，接种后湿
11、度控制在241C相对湿度保持在100%或叶面有水滴存在。7 .病情调查7.1 调查时间自然抗性分别在拔节期、大喇叭口期、抽雄期调查，人工接种分别在苗期接种7d后、成株期接种1416d进行抗性调查。7. 2调查方法田间根据症状特征调查发病情况，调查被接种部位的上、下叶片，根据对病害症状的描述，随机抽取鉴定圃中间3行的玉米叶片80100个，逐叶进行调查记载严重度、普通率和病情指数。8. 3病情分级田间病情分级、相对应的症状描述见表1。表1玉米抗北方炭疽病鉴定病情级别划分病情级别症状描述0叶片上无病斑1仅在穗位下部叶片上有少量病斑，病斑占叶面积少于懿3穰位卜部叶片上有少量病斑，占叶面枳6%10%,槐
12、位上部叶片有零星病斑5穗位下部叶片上病斑较多，占叶面积IK30%,槐位上部叶片有较多病斑7穗位上部叶片有大量病斑，病斑相连，占叶面积31%70%,下部病叶枯死9全株叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死7. 4普遍率计算每一鉴定材料随机调查80100片叶，计数发病叶片数，计算普通率。普通率（%）=（发病叶片数/调查总叶片数）100%8. 5病情指数计算每一鉴定材料随机调查80IOO片叶，分别记载病情级数，计算病情指数病情指数=E（各级病叶数X各级代表数值）/（调查总叶片数X最高级代表值）XlO0%8抗性评价8. 1有效性判别当感病对照品种的病情级别达到7级时，该批次鉴定有效。9. 2抗性评价标准依据鉴定
13、材料的病情级别确定其抗病水平，划分标准见表2表2玉米抗北方炭疽病的评价标准最高严重度级别抗性类别缩写类别O级I免疫1级HR高抗3级R抗5级MR中抗7级S感9级HS高感8.3重复鉴定同一鉴定品种两年鉴定抗性类别不同的，则需要做第三次抗性鉴定。8.4抗性评价根据重复抗性鉴定结果对鉴定材料进行抗性评价，抗性以记载的最高病情级别为准。8.5鉴定记载表格玉米抗北方炭疽病的记载表格见表3。表3玉米抗北方炭疽病的记载表鉴定方法：鉴定地点:播种时间：接种时间：接种菌株：调查时间:品种编号品种名称品种来源各级严重度级别数最高严重度级别抗性类别。级1级3级5级7级9级鉴定人：年月日复核人：年月日9鉴定报告9.1鉴
14、定报告一般以单个品种单独出具。如集中批量送样的，也可以多个品种出一份报告。9.2鉴定报告要盖鉴定单位公章，要有鉴定人和复核人签字。附录：附录A(规范性附录)玉米北方炭疽病症状、玉蜀塞出芽短梗塞苗形态特征A.1玉米北方炭疽病症状A.1.1眼状斑危害叶片，初期呈水浸状病斑，后渐扩大呈圆形、椭圆形或长圆形，草黄色，中央乳白色，边缘褐色，外围鲜黄色的狭窄晕环。A.1.2枯斑型病斑大小为0.5mm2.0mmX0.5mm1.5mm,病斑多相互融合，病斑正面中脉为淡褐色，形成不规则枯斑。A.2学名和形态描述A.2.1学名玉蜀黍出芽短梗霉菌AvreobasE加Zeae(NaritaetHiratsuka)Dingle异名：玉蜀黍球梗抱菌KabatiellazeaeNaritaetHiratsukaA.2.2菌落特征在PDA培养基上生长缓慢、菌落革质，呈放射波纹状，表面有极短的粉末状菌丝，初呈乳白色，随着菌龄增加，颜色
