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1、1.nNAME对肝硬化大鼠胃肠道中一氧化氮合酶亚型表达的影响doc1.11NAME对肝硬化大鼠胃肠道中一氧化氮合陶亚型发达的影响【关键词】大鼠关键词：大鼠；肝硬化；一氧化氮合酶；免疫组织化学；WeSternblot摘要：目的探讨一氧化氮合酶亚型(NOS1,N0S2,N0S3)在肝硬化大鼠胃肠道中的表达,并探讨NOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯(1.-NAME)对其表达的影响.方法制作大鼠四氯化碳中毒肝硬化模型，肝硬化模型大鼠随机分为NO合醐(NOS)抑制剂治疗组和未治疗组，模型治疗组用1.-NAMEO.5mg#12539;kg-1#12539;d-1,胃内注入，每日1次，治疗IOd.免疫组织化学
2、染色显示胃肠道组织中各型NOS的染色强度和分布，Westernblot法检测胃肠道组织中各型NOS的表达.结果模型组大鼠胃、小肠、结肠组织中的NOS染色强度显著弱于正常比照组和1.-NAME治疗组大鼠.Westernblot显示在肝硬化模型大鼠胃、小肠、结肠组织中的各型NOS表达均明显降低，1.-NAME治疗后又复原至接近正常.结论肝硬化大鼠胃肠道组织中各型NOS的表达明显削减，1.-NAME时其表达有调整作用.Keywords:rat：livercirrhosis;nitricoxidesynthase：im-munohiStochemistry:WesternblotAbstract:AI
3、MToinvestigatetheeffectof1.-NAMEonex-pressionofthenitricoxidesynthase(NOS)isoformsinthecirrhoticratintestine.METHODSRatswithcirrhosisin-ducedbycarbontetrachloridewererandomlydividedintotwogroupsonereceiving.5mg#12539：kg-1812539;d-lofNG-nitro-1.argininemethylester(1.-NAME)duringld,whereastheothergrou
4、pandcontrolwereadministratedthesamevolumeofsaline.ImmunohistochemicalSABCmethodwasusedtoobservetheexpressionanddistributionofthreeisoformsofNOSingastrointestinaltractofrats.WesternblottingwasusedtodetectexpressionofgastrointestinalNOSisoforms.RESU1.TSNOSisoformsstainingintensitiesweremarkedly1owcrin
5、cirrhoticratintestinethanthecontrolandcirrhoticratsafterbeingtreatedWith1.-NAME.CONC1.USIONEx-pressionsoftheNOSisoformsweresignificantlyreducedinthecirrhoticratintestine.Maybethereisaregulationof1.-NAMEonexpressionofthegastrointestinalNOSisoformsincirrhoticrats.O引言NO作为一种神经递质和信使分子，具有多种生理功能，在神经传导和胃肠道功
6、能调整中起重要作用1-3.NO与肝硬化胃肠运动、粘膜分泌、粘膜免疫功能有亲密的关系4-6.我们应用NOS特异性抑制剂治疗肝硬化模型大鼠，视察其胃肠道NOS表达的变更，旨在探讨NOS在肝硬化大鼠胃肠道中的变更规律，为进一步探讨NO在肝硬化胃肠道功能变更中的作用奠定基础.1材料和方法1.1材料试验动物为雄性SD大鼠（本校试验动物中心供应），共36只，体质量（25050）g,食用标准颗粒饲料，随机分为两组：模型组26只，正常比照组10只.按文献所述方法，制作四氯化碳（CC14）中毒性肝硬化模型.模型组3ml.ttl2539;kg-1CC14腹部皮下注射，每周2次,共12wk;正常比照组3m1.#12
7、539:kg-1体质量橄榄油腹部sc,每周2次，共12wk.12wk末，肝硬化模型建立后随机分为治疗组和未治疗组，另取同批正常SD大鼠作为比照组，每组10只.模型治疗组用NOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯（1.-NAME,Sigma产品），0.5mg#12539;kg-1#12539:dT,ig;模型未治疗组和正常比照组用生理盐水灌胃，每日1次，均为10d.1.2方法常规40g#12539：1.-I多聚甲醛液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下视察肝脏组织变更.3组动物随机各取5只，10g#12539;1.-I戊巴比妥钠50m1.#12539：kg-1,ip麻醉后，开胸行左心室插管，先用冷生理盐
8、水灌洗，再以40g#12539;1.-I多聚甲醛灌注固定1.5h,快速取小部分胃、小肠、结肠组织，移至200gtt12539：1.-I蔗糖液浸泡24h（4C下），至组织完全沉底，在-20C下行冰冻切片，厚度有1416m（帖于载玻片上，37C过夜）.用0.OInnnOl#12539;1.-IPBS（pH7.4）洗5min3,过氧化氢甲醇处理15min,PBS振洗5min3,正常羊血清封闭30min后,加入兔抗NOSl（1：100,兔多抗），N0S2（1：100,兔多抗），N0S3（1：100,兔多抗）在4孵育过夜.PBS振洗5min3,加入生物素化的羊抗兔TgG抗体，37,C30min.0.01
9、mmol#12539;1.-IPBS洗5min3,滴加试剂SBC,37,C30min.0.Olmmol#12539：1.-IPBS洗5min4,DAB显色（免疫组化试剂由武汉博士德生物工程有限公司供应）.苏木素复染后常规脱水透亮，中性树胶封片，显微镜视察并照相.试验前12h禁食，不禁水.随机处死比照组、模型组和治疗组动物各3只，快速剖腹分别取其胃，小肠和结肠，于冰盐水（含O.ImmoI#12539;1.-IPMSF）中清洗干净.马上液氮中速冻，然后移至-70C冰箱保存，此过程均在5min之内完成.配制三去污组织裂解液，去离子水配制，称量鼠胃肠组织，按每份组织加5份组织裂解液（mV）的比例加入裂
10、解液，于冰水中匀浆组织，3500r#12539;min-1,5s5,然后以10000g,离心IOmin,取上清分装贮存于-70C备用于SDS-PAGE和Westernblot分析，同时用Bradford法测定提取液中蛋白质浓度.灌制80g#12539;1.-I的聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质样品加2SDS上样缓冲液,加热100C3min,再次离心后上样等量的蛋白质样品.20m恒流电泳，结束后凝胶用考马斯亮蓝R250染色.同时各组鼠的胃，小肠和结肠蛋白质提取物用8g#12539;1.-ISDS-PAGE进行分别，电泳结束后，用半干电转印仪（北京六一厂）将蛋白质电转印到硝酸纤维素膜上（转移缓冲液：25mm
11、ol#12539;1.-ITris-HCl,192mmoW12539;1.-I甘氨酸,10g#12539;1.-ISDS,20m1.#12539;1.-I甲1,pH8.3）.0.8mA#12539;cm-2恒流转印lh,TBSpH7.550gtt12539;1.T脱脂奶粉+0.5g#12539：1.-IXP-40室温下封闭2h,用含0.1g#12539;1.-IBSA的TBS缓冲液稀释兔抗NOSl（1：100,兔多抗），N0S2（1：100,兔多抗），N0S3（1：100,兔多抗，4C孵育1618h,TBS洗IOmin3,TBS稀释IIRP标记的羊抗兔（1：400,博士德公司产品）二抗室温作用
12、2h,TBS+1g#12539;1.-IW-40洗10min5,DAB显色.2结果模型大鼠肝、脾肿大，肝脏质地变硬，边缘钝，表面不光滑，有大小不等的小结节，光镜示肝细胞再生，脂肪变性,胶原纤维组织增生，有明显的假小叶形成.2.1胃肠道组织内NOSNOS免疫组织化学染色显示，NOSl,N0S2和N0S3在胃肠道粘膜固有层有相像的分布，主要存在于胃肠道粘膜固有层间质的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和部分淋巴细胞.另外NOSl还存在于胃肠道壁内肌间神经丛，N0S2存在于粘膜下层血管内皮细胞.正常大鼠胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层下1/3,小肠在绒毛间质中，结肠则散在于粘膜绒毛间质中，上皮细胞均为
13、阴性.而肝硬化大鼠胃肠道各段NOS阳性细胞数明显减少，胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层基底部.用1.-NAME治疗的肝硬化大鼠胃肠组织中NOS阳性细胞数和神经丛中NOS染色强度明显强于肝硬化模型未治疗组（Figl）.2.2SDS-）PAGE和Westernblot检测SDS-PAGE显示各组大鼠胃，小肠和结肠的全层组织蛋白质构成比例是不同的，小肠组织中低分子量的蛋白质较多.而在不同组大鼠的同一组织中蛋白质构成比例却无明显差别（Fig2）.Westernblot显示肝硬化组大鼠胃，小肠和结肠组织中各型NOS的表达均是降低的.肝硬化大鼠经1.-NAMR治疗后胃肠道各段NOS表达又有所增加.但各组
14、大鼠小肠中均未检测出NOSl和N0S3,肝硬化大鼠小肠中甚至未检测出N0S2(Fig3D).3探讨NOS是NO合成的关键限速醉，广泛存在全胃肠道组织中，依据NoS生物学特性和编码基因不同可分3型.神经元型nN0S(NOSI),内皮型eNOS(NOSlII)和诱生型iNOS(NOSll),它们之间有50%的同源性.NOSI主要存在于神经细胞和上皮细胞；NOSH最初是从巨噬细胞分别出来的，后来发觉他们也存在于其他细胞，如血管平滑肌细胞;YOSIn主要存在于血管内皮细胞.依据NOS酶活性对Ca2+/CaM的依靠性不同将NOS分为2类，一类是构建型NOS(cNOS),NOS1和NoSnI都屈于此类，其
15、活性受Ca2+/CaM的调控，使NO的释放呈间歇、脉冲式发挥对机体的爱护作用.cNOS主要存在于正常血管内皮细胞，亦存在于肾上腺、血小板、成纤维细胞、PMN.脑以及某些非胆碱能非肾上腺素能神经末稍.另一类是诱生型NOS(NOS),NOSII屈于此类，其随活性不依靠于Ca2/CaM,但须要有诱导因子的存在.iNOS主要存在于内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肝细胞、肥大细胞和肾基底膜细胞等771.在某些病况下，胃肠道组织中NOS表达不同.腹腔炎性病时，小肠壁内iNOS阳性细胞主要分布在粘膜固有层，80%以上为CD45阳性的各类炎性细胞，约15%为CD3阳性的
16、T淋巴细胞，而上皮细胞均为阴性12;溃疡性结肠炎时，iNOS阳性细胞主要分布在肠上皮细胞，粘膜固有层细胞均为阴性13,肝硬化时尚不清晰.我们的探讨显示，NOSl,N0S2和N0S3在胃肠道粘膜固有层有相像的分布，主要存在于胃肠道粘膜固有层间质的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和部分淋巴细胞.另外NOSl还存在于胃肠道壁内肌间神经丛，N0S2存在于粘膜下层血管内皮细胞.正常大鼠胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层下1/3,小肠在绒毛间质中，结肠则散在于粘膜绒毛间质中，上皮细胞均为阴性.而肝硬化大鼠胃肠道各段NOS阳性细胞数明显削减，胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层基底部.用1.-NAME治疗的肝硬化大鼠胃肠组织中NOS阳性细胞数和神经丛中NOS染色强度明显强于肝硬化模型未治疗组.提示肝硬化时大鼠胃肠道各段NOS表达削减，而1.-NAME灌胃治疗IOd后胃肠道各段0S表达乂有所增加.我们用West
