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1、etvl在胃肠道间质瘤中的特异性表达ETVl在胃肠道间质瘤中的特异性表达【摘要】目的：探讨ETVl在胃肠道间质瘤组织中的表达及临床意义。方法：应用免疫组化、实时荧光定量1,CR.Western-blot检测ETVl在135例不同胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织及瘤旁组织中的表达。结果：免疫组化结果显示，ETVl在胃肠道间质瘤中阳性表达率为68.1%,显著高于瘤旁正常组织的5.2%(P0.05).荧光定量PCR方法显示，间质痛组织中ETVl的相对表达Ct值(3.302.37)低于痛旁正常组织的(6.192.86),肿瘤组织中ETVl的表达是正常组织的7.41倍，差异有统计学意义(P0.OOD0West
2、ern-blot法检测显示，ETVl蛋白在胃肠道间质瘤中的表达水平(1.240.67)也较瘤旁正常组织高(0.880.28)(P=0.0369)：Pearson相关分析显示，ETVlmRNA和蛋白水平呈正相关(r=0.526,P=O.017).结论：ETVl在胃肠道间质痛中特异性高表达，可能与胃肠道间质瘤的发生发展有关，有望成为新的肿瘤标记物，为临床治疗供应新靶【关键词】胃肠道间质瘤；转录调控因子；肿痛发生AbstractObjective：ToinvestigatetheexpressionofETVlingastrointestinalstromaltumorsanditsclinical
3、significance.Method：Surgicalgastrointestinalstromaltumortissuesandadjacent,normalmucosawereobtainedfrom135patientswithgastrointestinalstromaltumor.ImmunohistochemistrywasconductedtodetectthedistributionofETV1protein,whi1ethequantitativereal-timereversetranscriptasepolymerasechainreactionandWesternbl
4、otmethodwereusedtodetecttheexpressionsofETV1mRNAandprotein.Result：Immunohistochemica1analysisshowedthepositiverateofETVlexpressionwas68.1%ingastrointestinalstromaltumortissues,itwassignificantlyhigherthan5.2%intheadjacentnormalsamples(PO.05).Fluorescencequantitativepolymerasechainreaction(PCR)showed
5、thatrelativeexpressionofCtvaluewas(3.302.37)ingastrointestinalstromaltumortissuesitwassignificantlylowerthan(6.192.86)inadjacentnormalsamples,expressionofETVlintumortissuewas7.41timesofnormaltissue,thedifferencewasstatisticalIysignificant(PO.001).WesternblotanalysisrevealedthattheexpressionofETV1pro
6、teinwas(1.240.67)itwasingastrointestinalstromaltumortissues,significantlyhigherthan(O.880.28)innormalcolorectaltissues(P=0.0369).PearsoncorrelationanalysisshowedthatthemRNA1eve1wasinpositivecorrelationwiththeproteinlevel(r=0.526,P=0.017).Conclusion：ThespecificexpressionoftheETVlisinacorrelationwitht
7、hepathogenesisofgastrointestinalstromaltumor.ETVlisexpectedtobeanewtumormarkerandthenewtargetforclinicaltherapy.KeywordsGastrointestinalstromaltumor；Transcriptionregulatoryfactors；TumorigenesisFirst-authorsaddress：TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangUniversityMedicalCollege,Hangzhou310000,Chinadoi：1
8、0.3969j.issn.1674-4985.2014.25.OOlETS家族是最大的信号依竟转录调控因子家族之一，其过度表达和很多人类肿瘤发生有关，近年来已成为各国学者关注的重点。ETS变异体1(ETV1,ER81)是ETS家族成员之一。已有探讨表明，ETVl在乳腺癌、黑色素痛、前列腺癌、尤文氏痛中过度表达，参加肿瘤的形成和发展国外已有探讨发觉，ETVl在胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumor,GIST)细胞中存在普遍高表达6,但是国内鲜有相关报道。本试验采纳免疫组织化学、实时荧光定量PCR和Western-blot方法检测GlST及瘤旁正常组织中ETVl的表
9、达，探究其表达差异的意义。1材料与方法1.1标原来源选取本院2012年5月-2014年1月经手术治疗的GIST患者135例。其中男68例，女67例，年龄2483岁，平均(58.711.8)岁，中位年龄59岁。肿瘤发生部位包括胃104例，小肠24例，其他部位7例。全部手术病例均为初治，术前均未行放、化疗或伊马普尼等分子靶向治疗;GIST标本取H病灶中心无坏死部分，另取距肿痛边缘大于3Cm的瘤旁正常组织，离体后马上切成大约0.5cm小块，于IOmin内放于液氮中保存，后转存于-80冰箱。部分标本用4%甲醛固定，石蜡包埋，做免疫组化染色。全部标本均经过病理科医师证明为GISTo本试验获得医院伦理委员
10、会同意。1.2免疫组化染色组织石蜡包埋制成厚约4m组织切片，常规HE染色和免疫组化染色。每批染色均用已知阳性切片做阳性比照，用PBS代替一抗做阴性比照。结果判定：以胞质、胞核或胞膜染有匀称棕黄色颗粒、染色强度高于背景非特异性染色者为阳性细胞。采纳双盲法，选取5个高倍视野进行计数。按半定量评分方法进行计算：依据每视野着色细胞占总细胞的数目（阳性细胞0、序25以26%50%.50%）分别记为0、1、2、3分：按每张切片着色细胞的染色强度（阴性、弱、中、强）分别记为0、1、2、3分;依据两项评分之和推断结果：2分为阴性，3为阳性。1.3RT-PCR检测ETVlInRNA表达1.3.1总RN提取称取1
11、00mg组织，匀浆后用TRIzol法进行GlST组织及瘤旁组织的总RNA提取。紫外分光光度计定量并检测其纯度，A260/A280比值在1.82.Oo依据TakaraPrimcScript?RTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectReal1Hme）试剂盒（Takara公司）说明书步骤将其逆转录为cDNA。1.3.2实时荧光定量PCRETVl正向引物为5-GCAGTCAAGAACAGaCTTTAT,反向引物为5-TCGGT11CGGTGTTGGTTG-3。以GAPDH为内参照，其正向引物为5-GGGCTGGGGCTC11TG-3,反向引物为5-AGGGGCCATCCAC
12、AGTCTTe-3。acDNA11.,依据SYBR?PrenIiXEXTaq?(TliRNaseHPlus)试剂盒(Takara公司)说明书步骤进行反应，95C预变性30s,随后进行40个循环的PCR扩增反应(95C变性5s,60退火与延长34s)o肿瘤组织与正常组织的相对表达Ct值，即?Ct=Ct(ETVl)-Ct(GAPDH)e肿符组织中ETVl表达相对于瘤旁正常组织的倍数用2-?Ct计算。1.4Westernblot法检测ETVl蛋白表达取100mg簇新组织，将组织粉碎后加入裂解液提取总蛋白，4C离心IOnlin,提取上清液，BCA法测定蛋白含量。在提取出的蛋白中加入适量5上样缓冲液煮沸
13、10min。取等量样本于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分别,电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)。5%脱脂牛奶室温封闭2h,与兔抗人ETVl单克隆抗体或GAPDH单克隆抗体4C孵育过夜，洗膜，与辣根过氧化物除(HRP)标记的羊抗兔多克隆抗体室温孵育1h,洗膜。用EC1.显色曝光。组织中不同蛋白表达水平用目的条带与内参GAPDH条带的灰度值比值定量表示。1.5统计学处理采纳SPSS19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(xs)表示，比较采纳t检验和单因素方差分析，计数资料用率表示，采纳字2检验，Kruskal-Wallis等级相关采纳Spearman方法，以PO.05为差
14、异有统计学意义。2结果2.1ETVl的免疫组化染色结果ETVl免疫组化阳性染色产物位于细胞核。ETVl在GIST中普遍高表达，阳性率达68.1%(92/135),但是在痛旁正常组织基本不表达，为5.2%(7/135),差异具有统计学意义(P0.05),见图U3探讨GIST是消化系统最常见的间叶源性肿瘤，它主要是由c-kit或者PDGFRA基因致瘤突变导致，发病率约为1/10万210万人，近年来呈明显增加的趋势。伊马替尼等分子靶向药物的应用，极大地提高了GIST的药物疗效。但是，伊马替尼的胜利应用并未根除间质瘤，肿痛复发和耐药成为影响疗效的关键因素7-8。因此，探究GIST表面分子特性，找寻新的
15、分子靶标已成为目前GIST诊治探讨的热点。ETS家族是最大的信号依靠转录调控因子家族之一，现已发觉30多个ETS家族成员，它们均含有一个由85个氨基酸组成的特异DNA结合区(ETSK),该区与靶基因启动区一个富含嗦吟的序列GGAT结合后调整基因转录。ETVl是ETS家族成员之一，ETVl及其相关ETS转录因子可以调控多能祖细胞分化，在组织发育过程中差异表达，过度表达促进细胞恶性变更970。在一些肿瘤中ETVl基因参加某些染色体易位突变，基因融合产生嵌合体蛋白导致细胞恶性变，被认为是促使肿痛发生的主要因素之一，如前列癌中ETVl和跨膜丝原酸蛋白酶2基因的融合、尤文氏肉瘤中ETVT和EWS基因的融合”,5前列腺癌中过度表达的ETVl也可以和雄激素受体作用促成肿痛的侵袭与转移11.其他肿瘤如黑色素瘤、乳腺癌中也存在ETVl蛋白过度表达，在调控肿瘤细胞增殖中起重要作用2-4o进一步探讨表明，ETVl对靶基因的作用由困难的调控网络进行调整。各种信号激活RasRafMAPK信号通路是调控ETVl的主要途径2,12-13oRasRafMPK通路的激活导致ETS转录因子活化，从而调控生长和周期相关基因，如c-myc、junB、cdc2和cyclinD13914。在ETS的参加作用下，Ras信号胜利转化成一系列生长、凋亡相关基因。在前列腺癌、黑色素瘤中，Ras-MAPK-ETVl通路进一步得到
