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1、免疫组化检测膀胱癌中netrin-1的表达、肺癌、结直肠癌及神经母细胞瘤免疫组化检测膝胱癌中netrin-1.的表达#*51015202530摘要：目的：通过比较不同病理分期膀胱癌组织标本切片中netrin1.表达量的差异，分析其与膝胱癌不同临床分期的病理参数关系，为膀胱癌的治疗供应新的方向。方法：选取临床膀胱癌组织标本切片100例，通过免疫组化检测netrinT表达量的差异及其定位。结果：Netrin-I在膀胱癌组织标本切片中随着病理分期的上升，表达量增加(P0.05),结论：Netrin-I表达量与膀胱癌临床病理分期显著相关，有望作为一种潜在的生物肿瘤标记物来预料膀胱癌的恶性程度并且可以预
2、示着肿瘤患者的预后及复发，并为探究膀胱癌的治疗供应新的方向。关键词：外科学：膀胱癌：组织切片：Netrin-I中图分类号：R694Inununohistochemica1.detectionofnetrin-1.expressioninb1.addercancer1.iuJiao,KongChuize(Thefirsthospita1.ofChinaMedica1.University,ShenYang110001)Abstract:ObjectiveBycomparingthedifferentexpressionsofnetrin1.indifferentpatho1.ogica1.sta
3、gingofb1.addercancertissuesiicesandana1.ysiswiththere1.ationshipbetweenb1.addercancerindifferentc1.inica1.stagesofpatho1.ogicparameterstoprovideanewdirectionforthetreatmentofb1.addercancer.MethodsSe1.ected100casesofc1.inica1.b1.addercancertissuesiices,detectedthedifferentexpressionsofnetrin1.anditsp
4、ositioningbyimmunohistochemistry.Resu1.tsTheexpressionsofnetrin-1inb1.addercancertissuesectionsincreasedwiththepatho1.ogica1.stageincreased(P0.05).Conc1.usionNetrin-Iexpression1.eve1.sweresignificant1.yre1.atedtothec1.inica1.patho1.ogica1.stagingofb1.addercancerandexpectedasapotentia1.bio1.ogica1.tu
5、mormarkerstopredictthedegreeofma1.ignancyofb1.addercancerandcanpredictprognosisandrecurrenceofthecancerpatientsandtoexp1.orethetreatmentofb1.addercancerdirection.Keywords:Surgery;B1.addercancer;Tissuesections;Netrin-I0引言J跨胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿痛，发病率逐年增高。欧美国家每年有一万余人死于膈胱癌。在美国，膀胱癌是男性第四位最常见的癌症,在死于癌症中占第九位，男女比例大约
6、是3:1.11膀胱癌的生物学行为极为多变，其发病机制以及发生发展的分子生物学基础至今不明，并且膀胱癌细胞对抗癌药物产生多药耐药，因此对膀胱癌的治疗效果尚不能令35人满足2依靠性受体在肿瘤发生发展中的作用越来越受关注。依据其特异性配体的存在与否，分别激活存活或凋亡两个截然相反的信号传导途径，引导细胞增殖或凋亡，从而导致肿瘤的形成或消退。膀胱癌的发展过程是多因素多阶段的，涉及到包括细胞周期的调控、基因启动子的转录活化、癌基因的失活、癌基因的活化和表遗传学在内的诸多方面。Netrin-I是神经导向因子，其依竟受体UNC5B属细胞膜受体，netrin-1家族受体之一，40在神经及血管发育过程中起着重要
7、的导向作用，可诱导细胞的凋亡。Netrin-1UNC5B信号通路在乳腺癌3456中起抑制凋亡作用，在细胞调T-亡过程中扮演着重要角色。但在膀胱癌中是否存在netrinT的表达以及在其发生发展中的作用机制目前尚不明确，为此，拟应用免疫组化检测并探讨netrin-1在膀胱癌中的表达并探讨其与临床病理学参数的关系。1材料与方法1.1材料一般资料451.1.1收集2008-2011于中国医科高校附属第一医院泌尿外科行手术治疗并且术后病理证明为膈胱福的患者唠胱癌组织标本100例，年龄40-75岁，平均年龄55岁，其中临床分期T1.、50T2期各30例，T3、T4期各20例，取材经中国医科高校附属第一医院
8、医学科学探讨伦理委员会批准。手术切除后的膝胱癌组织标本包埋制成切片后备用。主要试剂及仪器1.1.2兔抗人netrin-1抗体（bcamInc）,兔SP检测试剂盒（SP-9001）（中衫金桥），包括:3%11202去离子水，山羊血清工作液，山羊抗兔二抗工作液，辣根的标记链霉卯白素工作液。DAB55显色试剂盒（中衫金桥）0.01M(Ph=7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）（福州迈新试剂），多聚赖氨酸处理载玻片，盖玻片，梯度酒精，二甲苯，石蜡，柠椽酸钠缓冲液（pH=6.0）（福州迈新试剂），中性树胶（上海），高压锅，电磁炉，苏木素染色液（Beyotime）。1.2方法免疫组化检测netrin-1
9、的表达定位及其与临床病理学参数关系1.2.1606570选择符合探讨的T1-T4期的J跨胱癌4m厚的石蜡切片（T1.,T2期各30例，T3,T4期各20例），采纳链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶染色法（Streptavidin-perosidase,SP）免疫组化检测病理切片中netrin-1的表达，常规脱蜡，水化后进行预处理，加入0.0IM柠椽酸钠缓冲液，放入高压锅中加热，进行抗原修第，3%H202去离子水孵育IOmin,PBS洗3次，每次3min,封闭用正常山羊血清工作液（A液）室温下孵育IOmin,倾去，勿洗，加入兔抗人netrinT抗体（1:100-1:200）4C过夜，清洗后滴加生物素标记
10、羊抗免IgG（B液），室温下孵育10min,PBS洗3次，每次3min,滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液（C液）,室温下10min,PBS洗3次，每次3min,滴加显色剂DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素染色5min,战盐酸酒精分化，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透亮，中性树胶封固，用PBS代替一抗作为阴性比照，显微镜下视察，确定netrin-1在膀胱癌中的表达定位及不同临床分期表达量的差异，并结合临床，分析其与膝胱癌临床病理学参数关系。评估标准1.2.2以肿病细胞浆出现棕黄色颗粒着色为阳性。制定免疫组化标准：每例标本在400倍视野下随机选取500-1000个肿瘤细胞，视察阳性细胞染色强度，并计数阳性
11、细胞百分数，按细胞染色强度记为0-3分，无着色的记为0分，淡黄色的记为1分，棕黄色的记为2分，深棕75色的记为3分。按阳性细胞百分数的构成比记为0-3分：V1.OM己为0分，10%-25%记为1分，26%-50%记为2分，50%记为3分.以染色强度记分和阳性细胞百分数记分相加所得总分进行推断，总分07分为低表达（一），2分及其以上为高表达（+）O-2-1.2.3统计学分析用SPSSI3.O统计软件建立数据库和进行统计学分析。计量资料数据用s表示，数80859095100据中样本率的比较采纳2检验，生存多个影响因素采纳COX比例风险回来模型分析，P0.05认为差异有统计学意义。2结果采纳免疫组化
12、检测netrin-1的表达定位并分析其与临床病理学参数关系。免疫组化结果显示，nctrin-1在脐胱癌组织切片中的膈胱癌细胞核及细胞浆中存在表达，不同临床病理分期（T4,T3.T2,T1.期）的膝胱癌组织标本netrin-1的表达量存在明显差异（图1-4）,T4期膀胱癌组织标本中netrin-1表达量明显多于T1-T3期（PV0.05）,且T1.,T2,T3期组间比较差异均有统计学意义（PV0.05）o随着临床病理分期的上升，netrin-1的表达量增加。我们分析了netrin-1在膀胱癌组织标本切片中的表达水平与临床病理特征，包括年龄，性别，肿瘤部位，病理类型，肿痛浸润深度，淋巴结转移，淋巴
13、管或静脉渗透，远处转移，TNM分期，手术后曳发率之间的关系，表1将netrin-1在膀胱癌中的表达及其与临床病理因素之间的关系进行了总结，netrin-1高表达的膈胱癌患者的复发率较高，但无远处转移（P=0.013,2检验），netrin-1可能作为预料手术后肿瘤的复发。我们对T1-T4期患者术后熨发的危急因素做了分析。依据单因素分析，淋巴结转移(P=0.007)和netrin-1高表达(P=0.013),均为手术后肿痛复发可能存在的危急因素；多因素分析表明，netrin-1高表达为手术后膀胱癌复发的独立危急因素(P=O.021)O同时，我们对T1-T4期患者预后的危急因素也做了分析。依据单因
14、素分析，肿瘤的侵袭深度(P=0012),淋巴结转移(P=0.014)和netrin-1高表达(P=0.005),均为肿瘤患者预后可能存在的危急因素；多因素分析表明，netrin-1高表达是膀胱癌患者预后差的独立危急因素(P=O016)o图1-4:Netrin-I在T1.-T4期膀胱癌组织标本切片免疫组化Fig.1-4:Expressionofnetrin-1indifferentstagesofb1.addercancertissuesbyimmunohistochemistry-3-表1.Netrin-I表达及其与临床病理因素关系高表达(n=28)数量仃分比数量百分比低表达(n=72)临床病
15、理因素手术年龄P值V中位数(n=55)中位数(n=55)性别男性女性大小，mm101030305肿瘤的侵袭深度T=I12T=3,4淋巴结转移无有未知远处转移无有淋巴管渗透无有静脉渗透无WTNM分期1.I1.II1.1.V手术后复发-+a23探讨111739.2960.71343847.2252.780.58520871.4328.57611184.7215.280.634111239.2942.8617.8532281244.4438.8916.670.336111739.2960.71244833.3366.670.7271315046.4353.574328159.7338.891.380
16、.475a22678.5721.43531973.6126.390.64321785.015.0175523.6176.390.65720871.4328.57561677.7822.220.31419967.8632.14413156.9443.060.503151353.5746.43462663.8936.110.013*105Netrin-I属于神经导向因子，包括UNC5,UNC5B,UNC5C,UNC5D,DCC,neogenin)之一，在神经及血管发育过程中起着市要的导向作用，可诱导细胞的凋亡。Netrin-I对内皮细胞的70目前许多探讨证明netrin-1激活UNC5B受体，抑制血管8
