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1、 微生物生理生化鉴定 o目的要求目的要求o基本原理基本原理o实验器材实验器材o操作步骤操作步骤 目的要求o了解细菌生理生化反应原理以及在细了解细菌生理生化反应原理以及在细菌鉴定中的重要作用菌鉴定中的重要作用o掌握通过生理生化反应鉴别不同细菌掌握通过生理生化反应鉴别不同细菌的基本方法的基本方法 基本原理o 糖发酵试验：糖发酵试验：是鉴别肠道细菌的常用生是鉴别肠道细菌的常用生化反应。绝大多数细菌都能利用糖类作化反应。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，例如大肠杆菌能分力上有很大的差异，例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产
2、气；普通变形解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。糖。大肠杆菌：产酸产气大肠杆菌：产酸产气大肠杆菌分解糖类产生多种有机酸大肠杆菌分解糖类产生多种有机酸，使培养液呈，使培养液呈酸性；产生的甲酸在酸性条件下可进一步裂解生酸性；产生的甲酸在酸性条件下可进一步裂解生成成H2和和CO2发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂由紫色发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂由紫色(pH6.8)变变为黄色为黄色(pH5.2)；气体的产生可由倒置的德汗氏；气体的产生可由倒置的德汗氏小管中有无气泡来证明。小管中有无气泡来证明。糖发酵试验糖发酵试验 乳糖发酵试验乳糖发酵试验大
3、肠杆菌：大肠杆菌：+变形杆菌：变形杆菌： IMViC 试验试验 o IMViC是吲哚试验（是吲哚试验（indol test）、甲基红试验）、甲基红试验（methyl red test）、伏）、伏-普试验（普试验（Voges-Prokauer test） 和柠檬酸盐试验（和柠檬酸盐试验（citrate test）四个试验的）四个试验的缩写。这四个试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气肠缩写。这四个试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气肠杆菌，而且主要是用于水的细菌学检查，因为大肠杆菌，而且主要是用于水的细菌学检查，因为大肠杆菌虽非致病菌，但在饮水中若大肠杆菌超过一定杆菌虽非致病菌，但在饮水中若大肠杆菌超过一定数
4、量则表示受粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在数量则表示受粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。 IMViC 试验试验o 吲哚试验吲哚试验：用来检测细菌对色氨酸的利用能力。用来检测细菌对色氨酸的利用能力。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸，吲哚本身无色，不能氨酸产生吲哚和丙酮酸，吲哚本身无色，不能直接观察到，当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂直接观察到，当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，可形成红色的玫瑰吲哚。时，可形成红色的玫瑰吲哚。 吲哚试验吲哚试验大肠杆菌
5、：大肠杆菌：+产气杆菌：产气杆菌： 阳性阳性 阴性阴性IMViC 试验试验o 甲基红试验：甲基红试验：用来检测细菌发酵葡萄糖的产用来检测细菌发酵葡萄糖的产酸能力。当细菌代谢糖大量产酸时，就会使酸能力。当细菌代谢糖大量产酸时，就会使加入培养基中的甲基红指示剂由橘黄色加入培养基中的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（）变为红色（pH4.2），即甲基），即甲基红反应阳性。红反应阳性。 甲基红试验甲基红试验大肠杆菌：大肠杆菌：+产气杆菌：产气杆菌： 阳性阳性 阴性阴性伏伏- -普试验原理普试验原理产气杆菌：产气杆菌： V.P.试验阳性试验阳性大肠杆菌：大肠杆菌： V.P.试验阴性试验阴性V.P
6、试验试验大肠杆菌：大肠杆菌：产气杆菌：产气杆菌：+阴性阴性阳性阳性IMViC 试验试验o 柠檬酸盐试验：柠檬酸盐试验：用来检测细菌利用柠檬酸的用来检测细菌利用柠檬酸的能力。有些细菌能分解柠檬酸形成能力。有些细菌能分解柠檬酸形成CO2，由，由于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使pH升高，当用溴麝香草酚蓝作为指示剂时，升高，当用溴麝香草酚蓝作为指示剂时，培养基颜色发生变化。溴麝香草酚蓝变色范培养基颜色发生变化。溴麝香草酚蓝变色范围为，围为，pH6.0-7.6呈绿色，呈绿色，pH7.6时呈蓝色。时呈蓝色。 柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验大肠杆菌：大肠杆菌： 产气杆菌
7、：产气杆菌：+阳性阳性 阴性阴性 实验器材o 菌种：大肠杆菌，普通变形杆菌，产气肠杆菌种：大肠杆菌，普通变形杆菌，产气肠杆菌斜面各菌斜面各1支支 o 培养基：葡萄糖发酵培养基；乳糖发酵培养培养基：葡萄糖发酵培养基；乳糖发酵培养基（内装倒置的德汉氏小管）；蛋白胨水培基（内装倒置的德汉氏小管）；蛋白胨水培养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；柠檬酸盐斜养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；柠檬酸盐斜面培养基面培养基o 仪器或其他用具：培养箱，试管架，接种环仪器或其他用具：培养箱，试管架，接种环 操作步骤o 编号：用记号笔在各试管上分别标明培养基名称和所接编号：用记号笔在各试管上分别标明培养基名称和所接种的菌名。种的菌
8、名。o 接种：取盛有葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试管接种：取盛有葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试管各各3支，分别按编号支，分别按编号1支接种大肠杆菌，另支接种大肠杆菌，另1支接种普支接种普通变形杆菌，第通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。再将大肠杆菌支不接种，作为对照。再将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接种于和产气肠杆菌分别接种于2支蛋白胨水培养基、支蛋白胨水培养基、2支葡支葡萄糖蛋白胨水培养基和萄糖蛋白胨水培养基和2支柠檬酸盐斜面培养基中。支柠檬酸盐斜面培养基中。o 将上述已接种的试管和对照管置将上述已接种的试管和对照管置37温室中培养温室中培养2448小时。小时。o 观察结果。观察结果。o
9、 点燃酒精灯。右手持接种环，在火焰上灼烧灭菌。点燃酒精灯。右手持接种环，在火焰上灼烧灭菌。o 试管口靠近火焰旁，用右手的小指与掌间拔掉左手上两试管口靠近火焰旁，用右手的小指与掌间拔掉左手上两只试管上的棉塞，同时迅速将试管口在酒精灯上烧灼只试管上的棉塞，同时迅速将试管口在酒精灯上烧灼3s3s左右，使管口上可能沾染的少量杂菌得以烧死。左右，使管口上可能沾染的少量杂菌得以烧死。o 接种环轻轻接触菌苔，取出少许。注意接种环抽出时不接种环轻轻接触菌苔，取出少许。注意接种环抽出时不要碰到管壁和管口。要碰到管壁和管口。o 迅速将接种环伸入另一试管，在培养基上轻轻划线，接迅速将接种环伸入另一试管，在培养基上轻
10、轻划线，接种菌体于其上。划线时，要由底部起划较密的平行线，种菌体于其上。划线时，要由底部起划较密的平行线，一直划到顶部，以充分利用斜面表面积，同时不要将培一直划到顶部，以充分利用斜面表面积，同时不要将培养基划破。养基划破。o 烧灼试管口，将棉塞塞上。塞棉塞时不要移动试管，以烧灼试管口，将棉塞塞上。塞棉塞时不要移动试管，以免在移动中纳入可能含菌的空气。免在移动中纳入可能含菌的空气。o 将接种针在火焰上烧灼灭菌后放回原处。将接种针在火焰上烧灼灭菌后放回原处。结果观察o 将葡萄糖蛋白胨水试管中的培养液一分为二，分别用于将葡萄糖蛋白胨水试管中的培养液一分为二，分别用于甲基红试验和伏甲基红试验和伏-普试
11、验。普试验。 o 甲基红试验甲基红试验 ：沿试管壁向培养液加入甲基红试剂沿试管壁向培养液加入甲基红试剂4-6滴，滴，呈鲜红色者为甲基红试验阳性，呈橘黄色者为阴性。呈鲜红色者为甲基红试验阳性，呈橘黄色者为阴性。 o 伏伏- -普试验：普试验：在培养液中加入在培养液中加入40% KOH溶液溶液10滴，再滴，再加入等量的加入等量的5%萘酚溶液，用力振荡，再放入萘酚溶液，用力振荡，再放入37温箱温箱中保温中保温15-30 min如培养液呈红色为反应阳性。如培养液呈红色为反应阳性。 结果观察o 糖发酵试验糖发酵试验：产酸：指示剂使培养基由紫色（产酸：指示剂使培养基由紫色（pH6.8）转变为黄色（转变为黄
12、色（pH5.2）；产气：倒置的德汉氏小管内）；产气：倒置的德汉氏小管内有气泡产生。有气泡产生。o 吲哚试验吲哚试验：在培养液中加入乙醚约在培养液中加入乙醚约1 ml，充分振荡，充分振荡，使吲哚溶于乙醚中。静置片刻，待乙醚层浮于液面后形使吲哚溶于乙醚中。静置片刻，待乙醚层浮于液面后形成明显的乙醚层，再沿管壁加入吲哚试剂成明显的乙醚层，再沿管壁加入吲哚试剂8-10滴。如滴。如有吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色，为阳性反应。有吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色，为阳性反应。 结果观察o 柠檬酸盐试验：柠檬酸盐试验：观察培养基颜色变化，含有观察培养基颜色变化，含有溴麝香草酚蓝的斜面呈蓝色者为阳性反应，溴麝香草酚蓝的斜面呈蓝色者为阳性反应，呈绿色者为阴性反应。呈绿色者为阴性反应。 H2S试验试验
