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1、专题2 微生物的培养与应用课题课题1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养了解有关培养基的基础知识，进行无菌技了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。术的操作，进行微生物的培养。 一、课题目标：一、课题目标： 掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术、平板划线法等基本操作无菌技术、平板划线法等基本操作二、课题重点和难点：二、课题重点和难点：三、技能目标：三、技能目标：1.1.概念：概念：人们按照人们按
2、照微生物微生物对营养物质的不同需求，对营养物质的不同需求，配制出供其配制出供其生长繁殖的营养基质生长繁殖的营养基质。二二. .培养基培养基思考：微生物要生存繁殖，需要思考：微生物要生存繁殖，需要“吃吃”什么？什么？2.2.培养基的营养物质培养基的营养物质1.1.水水2.2.碳源碳源（提供碳元素的物质）（提供碳元素的物质）3.3.氮源氮源（提供氮元素的物质）（提供氮元素的物质）4.4.无机物无机物（无机盐）（无机盐）3.3.培养基的类型培养基的类型（1 1）按物理状态分：）按物理状态分：固体培养基固体培养基 半固体培养基半固体培养基 液体培养基液体培养基区别区别：加入琼脂的量决定培养基的物理状态
3、。：加入琼脂的量决定培养基的物理状态。注意：一般细菌不能利用琼脂。注意：一般细菌不能利用琼脂。 单个或者少数微生物在固体培养基表面生单个或者少数微生物在固体培养基表面生长繁殖长繁殖, ,可以形成肉眼可见子细胞的群体可以形成肉眼可见子细胞的群体菌菌落落固体培养基用途固体培养基用途：用于微生物：用于微生物纯化、计数、鉴定纯化、计数、鉴定液体培养基：工业生产液体培养基：工业生产表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长半固体培养基：观察运动半固体培养基：观察运动天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基化学成分不恒定的化学成分不恒定的天然有机物天然有机物如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养
4、基如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基化学成分完全了解化学成分完全了解的物质配制而成的培养基的物质配制而成的培养基（2 2）按化学成分划分：）按化学成分划分：鉴别培养基鉴别培养基将某种类微生物从混杂的微生物群体中将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离分离出来出来用于用于鉴别鉴别不同类型微生物的培养基不同类型微生物的培养基选择培养基选择培养基（3 3）按用途划分：）按用途划分：选择培养基和鉴别培养基的比较选择培养基和鉴别培养基的比较选择培选择培养基养基鉴别培鉴别培养基养基2.2.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实
5、验操作过程实验操作过程3.3.无菌的方法：无菌的方法：酒精灯旁操作酒精灯旁操作三三.无菌技术无菌技术防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.无菌的意义：无菌的意义：消毒与灭菌消毒与灭菌（1 1）消毒）消毒（2 2）灭菌）灭菌概念概念较为温和较为温和理化方法理化方法杀死杀死部分部分有害微生物有害微生物强烈强烈的理化因素的理化因素杀死杀死所有所有的微生物的微生物2.无菌的方法无菌的方法接种室内空气、接种箱、超净工作台接种室内空气、接种箱、超净工作台紫外线消毒紫外线消毒实验者的手臂、实验台等实验者的手臂、实验台等化学药剂消毒化学药剂消毒牛奶等不宜高温消毒灭菌的牛奶等不宜高温消毒灭菌的巴氏消毒巴氏消毒
6、日常食物、罐装食品日常食物、罐装食品煮沸消毒法煮沸消毒法适用范围适用范围方法方法（1 1）消毒）消毒培养基、实验器材培养基、实验器材高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌耐高温需干燥的物品（玻璃器耐高温需干燥的物品（玻璃器皿等）皿等）干热灭菌干热灭菌接种的工具、试管口、瓶口接种的工具、试管口、瓶口灼烧灭菌灼烧灭菌适用对象适用对象灭菌方法灭菌方法灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌箱干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅（2 2）灭菌）灭菌请你判断以下材料或用具是否需要消毒请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细
7、菌用的培养基与培养皿（2 2） 玻璃棒、试管、烧瓶玻璃棒、试管、烧瓶（3 3） 实验操作者的双手实验操作者的双手答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。我们已经对培养基和无菌技术有了一定的了解，我们已经对培养基和无菌技术有了一定的了解，你能不能用培养基进行大肠杆菌的纯化培养？你能不能用培养基进行大肠杆菌的纯化培养？大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基四四. . 实验操作实验操作（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H
8、 H2 2O O 定容至定容至1000ml1000mlNacl 5gNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g10g牛肉膏牛肉膏 5g5g琼脂琼脂20.0g20.0g1.1.计算：计算：依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂、搅拌琼脂、搅拌 补水定容补水定容4.4.灭菌：灭菌：5.5.倒平板：倒平板：（一）制备培养基（一）制备培养基培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌培养基高压蒸汽灭菌，培养
9、皿干热灭菌计算计算称量称量溶化溶化灭菌灭菌倒平板倒平板（一）制备培养基（一）制备培养基1.1.将培养皿放在将培养皿放在火焰旁火焰旁的桌面上，右手的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。123 42.2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过通过火焰火焰。3.3.用左手将培养皿打开用左手将培养皿打开一条一条稍大于稍大于瓶口的瓶口的缝隙缝隙，右手将锥形瓶中的培，右手将锥形瓶中的培养基养基( (约约101020mL)20mL)倒入培养皿，左倒入培养皿，左手手立即盖上立即盖上皿盖。皿盖。4.4.等待平板等待平板冷却凝固冷却凝固（约需（约需5
10、5 10min10min）。然后，将平板）。然后，将平板倒过来倒过来放放置，使皿盖在下，皿底在上。置，使皿盖在下，皿底在上。1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到5050左右时，才能用左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。度下降到刚刚不烫手即可。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
11、3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答：答：防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染 避免培养基中水分过快蒸发。避免培养基中水分过快蒸发。答：最好不要用这个平板培养微生物。答：最好不要用这个平板培养微生物。 防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。间的培养基上滋生。单个细胞单个
12、细胞单个菌落单个菌落（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌如何纯化？如何纯化？接种接种常见常见方法方法平板划线法平板划线法如何分散成单个细胞？如何分散成单个细胞？稀释涂布平板法稀释涂布平板法微生物群微生物群分散分散1.1.平板划线法：平板划线法：分区划线法分区划线法连续划线法连续划线法（1 1）概念与原理：）概念与原理：聚集的菌群聚集的菌群连续划线连续划线稀释分散稀释分散单个细胞单个细胞菌落菌落生长繁殖生长繁殖(2)“平板划线平板划线”实验操作实验操作（1 1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时灼烧接种环？在划线操作结束
13、时, ,仍然需要灼烧接种仍然需要灼烧接种环吗？为什么？环吗？为什么？杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者染环境和感染操作者接种结束后接种结束后杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端的菌种直接来源上次划线的末端，从而，从而使使每次划线时菌种数目逐渐减少每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到，直至得到单个细胞单个细胞每次划线前每次划线前杀死接种环上原有微生物杀死接种环上原有微生物取菌种前取菌种前目的目的灼烧时期灼烧时期（2 2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后）在灼烧接种环之后，为什么
14、要等其冷却后再进行划线？再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。（3 3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？么总是从上一次划线的末端开始划线？答：答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终，最终得到单个细菌繁殖而来的菌落。得到单个细菌繁殖而来的菌落。3 3个划线平板个划线平板1 1个不划线平板个不划线平板
15、（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）（3 3）培养）培养放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h2.2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法菌液的梯度稀释：菌液的梯度稀释：涂布平板操作：涂布平板操作：(1)(1)概念与原理：概念与原理：聚集的微生物聚集的微生物单个细胞单个细胞菌液梯度稀释菌液梯度稀释菌落菌落涂布平板涂布平板(2)(2)操作：操作：生长繁殖生长繁殖系列梯度稀释操作系列梯度稀释操作9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水 9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水9mL9mL无菌水无菌水注意：移液管需要经过注意：移液
16、管需要经过灭菌灭菌；试管口和移液管离；试管口和移液管离火焰火焰1 12cm2cm处。处。涂布平板操作：涂布平板操作：各梯度分别涂布各梯度分别涂布3 3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h（3 3）培养）培养1.1.临时保藏：临时保藏： 试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020三三 菌种的保存菌种的保存3 36 6个月，转移培养个月，转移培养 2分析下面培养基的配方：分析下面培养基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：脂。请回答： (1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是碳源和氮源的分别是_和和_。 (2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作想一想这种培养基对微生物是否具有选
